Регистрация / Вход
Прислать материал

Биорезорбируемые микроносители для доставки клеток в область заживления и регенерации ран

Докладчик: Мойсенович Михаил Михайлович

Должность: ведущий научный сотрудник лаборатории конфокальной микроскопии биологического факультета МГУ

Цель проекта:
1. Разработка микроносителей из безопасных биодеградируемых материалов для решения задач тканевой инженерии и регенеративной медицины имеет значительный потенциал, как в фундаментальном, так и прикладном значении. Создаваемая микроносителями трехмерная среда роста для культивируемых клеток является важнейшим фактором их дальнейшего нормального функционирования после введения в область травмы или другого поражения. Повреждения кожи являются удобной моделью как для отработки методов введения биодеградируемых микроносителей, так и для изучения их влияния на скорость заживления и регенерации тканей. Основной задачей проекта является разработка научных, методических и технологических основ для создания биорезорбируемого микроносителя, предназначенного для инъекций клеток разных типов в область заживления и регенерации ран. 2. Разработка нового биорезорбируемого микроносителя для направленной доставки клеток, вовлеченных в процессы регенерации

Основные планируемые результаты проекта:
1. В результате реализации проект будут разработаны научно-технические основы для создания отечественного микроносителя, предназначенного для целевой доставки клеток, обеспечивающих ускорение репарационных процессов и процессов регенерации. В качестве основы для создания микроносителя будут использован фиброин шелка и другие биорезорбируемые полимеры. Полученные микроносители будут охарактеризованы в соответствии с Программой и методиками исследовательских испытаний. С использованием методов световой и электронной микроскопии будет произведен анализ структуры микроносителя. In vivo будет исследован рост клеток разных типов, включая кератиноциты, макрофаги и фибробласты, на макроносителях. Влияние микроносителя на регенеративный потенциал будет изучен в моделях полнослойных ран кожи лабораторных мышей. Процессы заживления и регенерации будут изучены с использованием комбинации биометрических, гистологических и гистохимических методов. По результатам выполненных исследовательских испытаний будет проведена оценка эффективности и безопасности применения микроносителей и даны прогнозы о перспективах их использования для тканевой инженерии и регенеративной медицины.
2. Основные характеристики экспериментальных образцов биорезорбируемого микроносителя для направленной доставки клеток: экспериментальные образцы должны быть выполнены на основе фиброина и биологически активных веществ, влияющих на адгезию, пролиферацию и миграцию клеток, вовлеченных в процессы заживления и регенерации. В качестве таких веществ должны быть использованы производные компонентов внеклеточного матрикса. Экспериментальные образцы биорезорбируемого микроносителя для направленной доставки клеток должны быть стабильны в водных растворах в течении не менее 96 часов; при инъекции лабораторным животным в область раны, экспериментальные образцы биорезорбируемого микроносителя для направленной доставки клеток не должны являться причиной воспаления и отторгаться иммунной системой.
3. Проект будет выполняться с использованием апробированных и широко используемых при выполнении аналогичных исследований методик, которые будут модифицированы и/или адаптированы под задчи проекта.
4.В настоящее время уже используются разнообразные биорезорбируемые скаффолды для ускорения заживления и регенерации кожных ран, проводятся разработки композитных трансплантатов, однако многочисленные методологические проблемы, связанные с самой процедурой трансплантации, а также процессами спонтанной деградации до конца не решены [Horch RE, Debus M, Wagner G, Stark GB. Cultured human keratinocytes on type I collagen membranes to reconstitute the epidermis. Tissue Eng 2000;1:53–67].
Использование микроносителей является альтернативной технологией заполнения и активации регенерации обширных повреждений кожи. Микроносители – это частицы от 100 до 400 мкм в диаметре, которые изготавливаются из различных материалов и могут использоваться для прикрепления клеток и последующего введения в рану. Впервые такой подход был описан van Wezel и соавт. [van Wezel, A.L. The large-scale cultivation of diploid cell strains in microcarrier culture. Improvement of microcarriers. Dev Biol Stand 37, 143, 1976]. Первые микроносители были изготовлены из DEAE Sephadex А-50. В настоящее время до клинических испытаний были доведены только микроносители из модифицированного желатина [Liu, J.Y., Hafner, J., Dragieva, G., Seifert, B., and Burg, G. Autologous cultured keratinocytes on porcine gelatin microbeads effectively heal chronic venous leg ulcers. Wound Repair Regen 12, 148, 2004] и было достоверно показано, что они способствуют реэпителизации и уменьшению размера ран. В последнее время для изготовления микроносителей используют различные материалы: полистирен, коллаген, желатин, полилактид и др. [Microcarriers and their potential in tissue regeneration. [Martin Y, Eldardiri M, Lawrence-Watt DJ, Sharpe JR.Tissue Eng Part B Rev. 2011 Feb;17(1):71-80]. Данные последних исследований в этой области показывают, что введение в кожные раны пористых биорезорбируемыхмых микроносителей, загруженных культивированными кератиноцитами человека, способствовало не только оптимальной реэпителизации раны, но и стимулировало регенерацию всех поврежденных слоев кожи [Gustafson CJ, Birgisson A, Junker J, Huss F, Salemark L, Johnson H, et al. Employing human keratinocytes cultured on macroporous gelatin spheres to treat full thickness wounds: an in vivo study on athymic rats. Burns 2007;6:726–35]. Таким образом, разработка биорезорбируемых материалов для создания суспензионных препаратов для эффективного лечения глубоких дефектов кожи является чрезвычайно актуальной задачей.
5. Для достижения заявленных результатов в начале реализации проекта на основе анализа научно-технической и нормативной документации, а также результатов исследований, выполненных ранее, был проведен обоснованный выбор направления исследований по разработке биорезорбируемых носителей. Для достижения результатов в ходе реализации проекта должны быть решены конкретные задачи, исходя из этого выстраивался хронологический порядок проведения работ, были выбраны определенные теоретические и экспериментальные подходы и методы. Экспериментальные исследования будут выполняться с использованием стандартных модельных систем и методик, используемых для проведения исследованиях в данной области (методы работы с клетками млекопитающих, методы микроскопии, биохимические методы), а также модельных систем и методик, ранее разработанных участниками проекта, и модифицированных и адаптированных для выполнения конкретной научной задачи.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
1. Области применения: тканевая инженерия, регенеративная медицина, травматология, хирургия, косметология. Разработка и использование микроносителей из безопасных биодеградируемых материалов имеет значительный потенциал, как в фундаментальном, так и прикладном значении.
2. Микроносители могут быть использованы для решения задач клеточной биологии, например, воздействия ростовых факторов на дифференцировку стволовых клеток. Создание с их помощью адекватной трехмерной среды роста для многих клеток является важнейшим фактором нормального функционирования, что позволит изучать различные внутриклеточные процессы в состоянии, максимально приближенном к естественному. На основе микроносителей созданы модельные системы для исследования клеточной миграции, ангиогенеза, остеогенеза и других процессов. Кроме того, эта технология чрезвычайно перспективна в медицинском аспекте как основа для заполнения существенных кожных дефектов и ускорения регенерации кожных покровов, так и лечения повреждений различных типов тканей в условиях затрудненного к ним доступа. К ним относятся костная и хрящевая ткани, ткани печени, центральной нервной системы и др. С помощью гепатоцитов, культивированных на микроносителях возможно создание экстракорпорального биоискусственного устройства для пациентов с тяжелыми поражениями печени, ожидающими ее пересадки. Культивирование человеческих стволовых клеток на микроносителях позволяет сохранить их плюрипотентность и направлять их дифференцировку, что открывает широкие возможности их использования в области регенеративной медицины. Создаваемые биодеградируемые микроносители в виде суспензий могут использоваться и в качестве резервуаров для таргетной доставки лекарств при лечении широкого спектра заболеваний.
3. Поскольку проект направлен на разработку изделий медицинского назначения, предназначенных для заживления и регенерации ран, результаты проекта могут быть востребованы государственными и коммерческими организациями, деятельность которых связана с продвижением на рынок инновационных высокотехнологичных медицинских изделий и лекарственных препаратов. К таким организациям, например, можно отнести ЗАО НПП «МедИнж» и Центр Высоких Технологий "ХимРар". Основные направления деятельности включают научные исследования, разработку, внедрение и продвижение инновационных медицинских изделий, эндопротезов и инплантатов для человека.
Потребителем разрабатываемых изделий медицинского назначения могут быть специализированные медицинские учреждения и отделы лечебных учреждений общего профиля, деятельность которых связана с лечением заболеваний и повреждений различных органов. Примером таких учреждений являются: ГБУЗ МО "МОНИКИ имени М.Ф.Владимирского", ФГБУ "Российский онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина", ФГБУ «ФНЦ трансплантологии и искусственных органов им акад В.И.Шумакова», НИИ скорой помощи им. Н. В. Склифосовского, ФГБУ «Научный центр сердечно-сосудистой хирургии имени А.Н. Бакулева» Российской академии медицинских наук, ФГБУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Кроме того, на основе разрабатываемого прототипа изделия медицинского назначения впоследствии возможно создание линейки изделий, предназначенных для использования в различных областях тканевой инженерии и регенеративной медицины. Внедрение в клиническую практику биорезорбируемых микроносителей для доставки клеток в область заживления и регенерации ран позволит достичь значительного экономического эффекта за счет относительной дешевизны применяемой технологии, уменьшения количества перевязок, уменьшения трудозатрат персонала учреждений здравоохранения, а также существенного сокращения сроков лечения пациентов с повреждениями кожи и в послеоперационном периоде. Это напрямую связано с ожидаемыми социальными последствиями внедрения этой технологии, которые будут заключаться в улучшении качества жизни и скорейшем возвращении пациентов к полноценной жизни. Важной составляющей данного проекта является расширение фундаментальных представлений о механизмах регенерации и восстановления поврежденных тканей с использованием биорезорбируемых микроносителей для доставки клеток.

Текущие результаты проекта:
В связи с ограничением по времени выполнения 1 этапа проекта, на 2014 год были запланированы только теоретические изыскания, выбор и обоснование направления исследований и подготовка приборной и материальной базы для выполнения последующих этапов проекта. В соответствии с утвержденным план-графиком проекта на данный момент были получены следующие результаты: проведен аналитический обзор научной и научно-технической литературы, который показал, что использование клеточных технологий в терапии повреждений различных органов и тканей является перспективным направлением исследований, поскольку восстановление или замена поврежденного участка, а также нормализация функций происходит за счет оптимального соотношения вводимых клеточных факторов, что ускоряет этот процесс и делает его более эффективным. При лечении обширных повреждений методы клеточной терапии могут существенно сократить время заживления. При терапии ран кожи такой подход позволяет уменьшить вплоть до полного исчезновения образование рубцовой ткани. В результате того, что восстановление происходит путем индукции миграции и пролиферации клеток с соседних участков, восстановленная ткань практически не отличается по своим свойствам от окружающей здоровой ткани. Кроме того, такой подход снижает хирургическую нагрузку на пациента и является менее трудоемким для медицинского персонала. В настоящее время активно развивается направление использования клеток и биосовместимых материалов, выступающих в роли носителей. Такие материалы должны обеспечивать доставку, дифференцировку и миграцию клеток в месте повреждения, а кроме того впоследствии должны замещаться клетками нормальной ткани пациента, быть биологически безопасными и обладать адекватными механическими характеристиками. Для проверки свойств такой системы носитель-клетки, клетки и материал должны использоваться вместе, что дает возможность оценить биосовместимость, их взаимодействие и деградацию побочных продуктов. Простота в использовании конечного продукта будет иметь большое значение в его клиническом применении.
Одним из наиболее перспективных направлений тканевой инженерии и регенеративной медицины в настоящее время является разработка, исследование и клиническое использование комплексов, состоящих из искусственного внеклеточного матрикса и клеток, использующих матрикс как субстрат в результате их нанесения и культивирования in vitro или спонтанного заселения in vivo. Матрикс представляет собой изделие, которое отвечает таким требованиям, как биосовместимость, определенные механические, физические свойства и предоставляет субстрат для нормального функционирования клеток. Многими научными группами продолжается поиск адекватных носителей для трансплантируемых клеток, позволяющих упростить технологию трансплантации и усовершенствовать методики лечения заболеваний, обусловленных дефектами клеточных структур и тканей. Особое внимание уделяется разработке подходов к регенерации труднодоступных органов и тканей. Принципиальная возможность создания универсального биорезорбируемого изделия в виде суспензии пористого микроносителя, способного поддерживать жизнеспособность клеток разных типов, позволяет прогнозировать заметный прорыв в области регенеративной медицины. С помощью этой технологии ведутся работы по восстановлению крупных костных фрагментов, утраченных в результате травмы или заболевания, а также по ускорению васкуляризации различных трансплантатов. Эта технология актуальна и для лечения нейродегенеративных заболеваний, поскольку центральная нервная система имеет очень ограниченные возможности для самовосстановления, и введение в нее здоровых клеток может существенно повысить успешность лечения [Cherksey, B.D., Sapirstein, V.S., and Geraci, A.L. Adrenal chromaffin cells on microcarriers exhibit enhanced longterm functional effects when implanted into the mammalian brain. Neuroscience 75, 657, 1996; Saporta, S., Borlongan, C., Moore, J., Mejia-Millan, E., Jones, S.L., Bonness, P., Randall, T.S., Allen, R.C., Freeman, T.B., and Sanberg, P.R. Microcarrier enhanced survival of human and rat fetal ventral mesencephalon cells implanted in the rat striatum. Cell Transplant 6, 579, 1997]. Современные исследования в этой области сосредоточены и на создании жизнеспособных культивируемых трансплантатов, комбинированных с кератиноцитами или другими клеточными линиями.
Разработаны научные и технологические основы создания биорезорбируемого микроносителя для направленной доставки клеток: определен оптимальный состав и способ формирования носителей, разработаны методы виталлизации микроносителей, определены параметры, по которым будут оцениваться эффективность и безопасность использования разрабатываемого продукта.