Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка кандидатного лекарственного средства на основе противоопухолевого белка лактаптина и онколитического вируса осповакцины

Докладчик: Рихтер Владимир Александрович

Должность: заместитель директора, заведующий лабораторией биотехнологии, заместитель директора

Цель проекта:
1 Формулировка задачи/проблемы В XX-XXI веке рост числа онкологических заболеваний происходил такими быстрыми темпами, что дало основание для сравнения его с эпидемией. Ежегодная смертность от злокачественных новообразований в нашей стране составляет около 180 случаев у мужчин и 95 случаев у женщин на 100 тысяч населения. По прогнозам ВОЗ смертность от рака будет продолжать расти, и в 2030 году ожидается до 13 миллионов случаев смерти от онкологических заболеваний. Многие годы основными способами лечения онкологических заболеваний были хирургия и радиотерапия, направленные на удаление первичной опухоли. Применение "неспецифических" цитостатических и цитотоксических средств, а также гормонов для подавления роста метастазов существенно расширило возможности и повысило эффективность лечения рака. Однако, несмотря на высокую противоопухолевую активность используемых химиотерапевтических средств, продолжительность жизни пациентов с онкологическими заболеваниями увеличивается незначительно, и метастатический рост опухоли является одной из основным причин смертности. Кроме того, высокая общая токсичность большинства используемых противоопухолевых средств значительно ограничивает возможности их применения. Таким образом, на сегодня лимитирующими требованиями при создании противораковых препаратов являются минимальная токсичность по отношению к здоровым клеткам организма и максимальная эффективность по отношению к онкотрансформированным клеткам. Подобная селективность может быть обеспечена применением лекарственных средств, индуцирующих процессы апоптоза и аутофагии в клетках опухоли. Создание противоопухолевых лекарств на основе природных белков и пептидов, способных вызывать апоптотическую гибель раковых клеток и не повреждающих при этом здоровые клетки, является актуальным и активно развивающимся напрвлением. Также одним из активно развивающихся направлений исследований при создании противоопухолевых лекарственных средств является использование способности онколитических вирусов избирательно уничтожать опухолевые клетки, не оказывая значительного токсического воздействия на нормальные клетки организма. Подобное специфическое разрушение злокачественных клеток может происходить напрямую за счет преимущественной репликации вируса в этих клетках, или же оно может быть опосредовано иммунной системой, простимулированной вирусом Настоящий проект направлен на создание кандидатного противоопухолевого лекарственного средства на основе рекомбинантного штамма вируса осповакцины с двойной делецией генов тимидинкиназы и ростового фактора и встройкой в делетированные участки генома двух трансгенов – апоптоз-индуцирующего белка лактаптина (фрагмента каппа казеина человека) и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) человека. 2 Формулировка цели реализуемого проекта; конечного продукта, Цель проекта: Разработать кандидатное лекарственное средство с направленной иммуностимулирующей и апоптоз-индуцирующей противоопухолевой активностью на основе рекомбинантного штамма вируса осповакцины, содержащего двойную встройку генов гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) человека и противоопухолевого белка лактаптина. Конечным продуктом, создаваемым с использованием результатов, планируемых при выполнении проекта, будет являться кандидатное лекарственное средство, с иммуностимулирующей (за счет ГМ-КСФ) и апоптоз-индуцирующей (за счет лактаптина) противоопухолевой активностью. Будет также проведено сравнительное исследование несекретируемой и секретируемой форм лактаптина в составе рекомбинантного вируса. Секреция апоптоз-индуцирующего белка может обеспечить дополнительное цитотоксическое действие на клетки, соседствующие с инфицированными рекомбинантным вирусом клетками внутри опухоли, за счет передачи лактаптина через межклеточное пространство. Ожидаемые результаты проекта, а именно высокоспецифичные и малотоксичные противоопухолевые агенты будут востребованы фармацевтическими компаниями, которые занимаются разработкой и производством новых противоопухолевых терапевтических средств, и практическим здравоохранением для терапии злокачественных новообразований и улучшения качества жизни онкологических больных.

Основные планируемые результаты проекта:
1 Краткое описание основных результатов
В ходе выполнения ПНИ будут получены следующие результаты:
Разработанные методики:
1 Методика конструирования и очистки инсерционной плазмиды для встройки гена лактаптина в район гена ростового фактора вируса осповакцины, штамм Л-ИВП.
2 Методика получения рекомбинантных штаммов вируса осповакцины (штамм Л-ИВП) методом временной доминантной селекции.

Экспериментальные результаты:
1 Инсерционные плазмиды для встройки гена лактаптина в район гена ростового фактора вируса осповакцины штамма Л-ИВП.
2 Экспериментальные образцы рекомбинантных штаммов вируса осповакцины, продуцирующего ГМ-КСФ и лактаптин (далее - экспериментальные образцы рекомбинантных штаммов).

Разработанные документы:
1 Промежуточные и заключительный отчеты о ПНИ
2 Отчет о патентных исследованиях,
3 Лабораторный регламент наработки и очистки рекомбинантных штаммов вируса осповакцины, продуцирующего ГМ-КСФ и лактаптин.
4 Программа и методики исследовательских испытаний экспериментальных образцов рекомбинантных штаммов и протоколы исследовательских испытаний
5 Рекомендации и предложения по использованию результатов поисковой ПНИ в реальном секторе экономики, а также в дальнейших исследованиях и разработках
6 Технико-экономическое обоснование разработки продукции с учетом технологических возможностей и особенностей индустриального партнера.
7 Проект технического задания на проведение ОТР по теме: «Создание опытно-промышленной технологии получения противоопухолевой субстанции на основе рекомбинантного штамма вируса осповакцины, продуцирующего ГМ-КСФ и лактаптин»

2 Основные характеристики планируемых результатов
Характеристики разработанных методик:
Разработанные в ходе выполнения ПНИ методики получения рекомбинантных штаммы вируса осповакцины должны обеспечить:
- масштабирование в лабораторном и промышленном производстве;
- перенос технологических процессов для получения аналогичных препаратов.

Характеристики экспериментальных результатов:
1 Инсерционные плазмиды должны обеспечивать встройку гена лактаптина в район гена ростового фактора вируса осповакцины, штамм Л-ИВП. Наработка и очистка плазмидных ДНК должна быть проведена в условиях эндотоксин-фри. Выход очищенных плазмидных ДНК должен составлять не менее 50 мкг каждой.
2 Рекомбинантные штаммы вируса осповакцины должны:
- содержать две встройки генетического материала: первая - полноразмерная ДНК копия (кДНК) матричной РНК гранулоцитарно-макрофагального колониестиму-лирующего фактора человека (ГМ-КСФ) размером 850 п.н. (GenBank, Accession M11220.1); вторая – ген лактаптина. Оба гена должны экспрессироваться под контролем ранне-поздних промоторов вируса осповакцины. Ген ГМ-КСФ дол-жен быть встроен в район частичной делеции гена вирусной тимидинкиназы (ТК, J2R), а ген лактаптина – в район частичной делеции гена вирусного ростового фактора (VGF, C11R);
- сохранять генетическую структуру и экспрессировать встроенные гены ГМ-КСФ и лактаптина не менее чем в течение 20 пассажей на культуре клеток.
3 Экспериментальные образцы рекомбинантных штаммов должны быть получены в количестве не менее 2 и отвечать следующим требованиям:
- инфекционность не ниже 1х107 БОЕ/мл, где БОЕ – количество бляшкообразую-щих единиц, образованных вирусом на монослое клеток почки африканской зе-леной мартышки CV-1;
- аттенуация (ослабление вирулентности) не менее чем в 10 раз по сравнению с исходным штаммом Л-ИВП. Аттенуация должна быть измерена по величине 50%-ной летальной дозы (ЛД50) вирусов, исходного и рекомбинантного, для 10-дневных куриных эмбрионов;
- отсутствие острой токсичности и реактогенности при подкожном введении белым беспородным мышам в дозе не ниже 1х107 БОЕ/мышь
- вызывать 50%-ный литический эффект при дозе заражения не более чем 0,1 БОЕ/клетка в отношении не менее, чем одного вида раковых клеток человека.
- обеспечивать не менее 50% выживания животных с алло- или ксенотранспланта-тами опухолей при интратуморальном введении в дозе 1х107 БОЕ/мышь.

Характеристики разрабатываемых документов:
1 Оформление технической документации должно соответствовать требованиям ГОСТ 2.125-2008.
2 Состав отчетной документации, подлежащей оформлению и сдаче Получателем субсидии Минобрнауки России на этапах выполнения работ, определяется нормативными актами Минобрнауки России.

3 Оценка элементов новизны научных (технологических) решений
В настоящем проекте для усиления противоопухолевого эффекта лактаптина впервые использован вирус осповакцины, который и сам обладает природными онколитическими свойствами.
Впервые для конструирования рекомбинантного онколитического вируса используется комбинация генов иммуностимулирующего белка (ГМ-КСФ) и апоптоз-индуцирующего белка (лактаптин). Совместное введение в геном вируса генов апоптоз-индуцирующего белка и ГМ-КСФ будет приводить к усилению лизиса раковых клеток, одновременному высвобождению большого количества слабо иммуногенных опухолеассоциированных антигенов и презентации их иммунной системе организма. Такой подход создания противоопухолевых препаратов используется впервые
Авторы проекта также планируют сконструировать секретируемый вариант лактаптина в составе двойного рекомбинантного вируса осповакцины. Секреция апоптоз-индуцирующего белка может обеспечить дополнительное цитотоксическое действие на клетки, соседствующие с инфицированными рекомбинантным вирусом клетками, внутри опухоли за счет передачи лактаптина через межклеточное пространство. Этот эффект, известный как эффект свидетеля (bystander effect), ранее был показан для гена тимидинкиназы вируса простого герпеса HSVtk (Алексеенко И.В. и др., (2011) Доклады Академии наук).
Таким образом, в результате выполнения проекта будут получены результаты, способные к правовой охране, а именно: инсерционная плазмида, обеспечивающая встройку гена лактаптина в район гена ростового фактора вируса осповакцины; и рекомбинантные штаммы вируса осповакцины с встроенными генами лактаптина и ГМ-КСФ, обеспечивающие продукцию секретируемого и несекретируемого варианта белка.

4 Сопоставление с результатами аналогичных работ
В настоящее время создание противоопухолевых препаратов на основе природных белков и пептидов, способных вызывать апоптотическую гибель раковых клеток и селективно подавлять рост опухоли является одним их активно развивающихся направлений поиска новых противораковых лекарственных средств. Такие проапоптотические соединения белковой природы как цитокины семейства фактора некроза опухоли, интерфероны, интерлейкины, некоторые вирусные белки (апоптин, белок NS1 парвовируса грызунов, белок E4orf4 человека), рибонуклеазы (онконаза, биназа, барназа), кротамин, белки и пептиды молока являются основой противораковых лекарств, которые уже используются в клинической практике или проходят различные этапы доклинических и клинических испытаний [Dimberg L.Y., 2012; Argiris K., 2011; Fang E.F., 2011; Hayashi M.A., 2012; Barbana C., 2011; Koval O.A., 2014]
Также одним из активно развивающихся направлений исследований при создании противоопухолевых лекарственных средств является использование способности некоторых вирусов избирательно уничтожать опухолевые клетки. Такие онколитические вирусы способны специфично разрушать злокачественные клетки, не оказывая значительного токсического воздействия на нормальные клетки организма. Подобное специфическое разрушение злокачественных клеток может происходить напрямую за счет преимущественной репликации вируса в этих клетках, или же оно может быть опосредовано иммунной системой, простимулированной вирусом [Sheridan C., 2013;; Schmidt C., 2013; Cawood R., 2012; Tedcastle A., 2012]
Природными онколитическими свойствами обладают многие вирусы, но вирус осповакцины (vaccinia virus, VACV) занимает среди них особое положение. Структурно-функциональная организация этого вируса хорошо изучена, и он имеет длительную историю успешного медицинского применения в качестве живой противооспенной вакцины. В онкотерапии используют аттенуированные штаммы VACV. Показано, что подавление генов тимидинкиназы (ТК) и ростового фактора (VGF, virus growth factor) VACV приводит к практически полному отсутствию репликации вируса в неделящихся клетках [McCart, 2007, US Patent N 7208313], при этом эффективность разрушения раковых клеток такими двойными мутантами (VVdd) не отличалась от исходного штамма [Thorne S., 2007].
Для увеличения онкоспецифичности и онколитической активности VACV используют способность этого вируса нести большое количество введенных инородных генов (трансгенов) [Кочнева Г., 2012]. В качестве трансгенов в геном вируса осповакцины вводили гены цитокинов и иммуномодуляторов, ингибиторов ангиогенеза, а также ферментов, превращающих внутри опухоли нетоксичные предшественники (prodrugs), в их цитотоксические производные [Ziauddin M, 2010; Guse K, 2010; Chalikonda S, 2008]. Полученные рекомбинантные VACV показали хороший противоопухолевый эффект в доклинических испытаниях.
В настоящее время три рекомбинантных штамма VACV, разрабатываемые американской компанией Jennerex Biotherapeutics, проходят клинические испытания в качестве противоопухолевых препаратов: онколитический вирус JX-929 (имеет делеции ТК и VGF генов, и вместо последнего встроен ген цитозиндезаминазы) проходит I фазу клинических испытаний для лечения рака яичников на стадии метастазов [Lee J, 2010]; JX-594 (введения гена гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) человека в район ТК-гена) успешно прошел I и II стадии клинических испытаний против первичного рака печени и меланомы [Marchesi V., 2013].
К настоящему времени известны ретровирусные конструкции, несущие ген апоптина, и показана избирательная индукция апоптоза раковых клеток с использованием таких векторов [Noteborn M., 2005]. Сконструированы рекомбинантные аденовирусы, экспрессирующие апоптин, и на модели опухолей печени человека в бестимусных мышах показана их противоопухолевая активность [Noteborn M., 2007; U.S. Zhang K-J., 2012].
Методы противоопухолевой терапии с использованием онколитических вирусов разрабатываются и в России. Сотрудники ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (г. Новосибирск) показали увеличение эффективности противоопухолевого действия вируса осповакцины при введении в его геном гена проапоптотического белка вируса анемии птиц – апоптина [Кочнева Г.В., 2013ю].
Введение в геном онколитических вирусов генов иммуностимулирующих белков (в частности ГМ-КСФ) индуцирует специфический противоопухолевый иммунитет и усиливает онколитическую активность вирусов за счет нарушения внутриопухолевой васкуляризации [Marchesi V., 2013].
Перспективным представляется создание рекомбинантного варианта вируса осповакцины с введением в геном VACV двух трансгенов: гена апоптоз-индуцирующего белка и гена ГМ-КСФ человека, что будет приводить к усилению лизиса раковых клеток, одновременному высвобождению большого количества слабо иммуногенных опухолеассоциированных антигенов и презентации их иммунной системе организма. Именно этот подход будет использован в данном проекте при выполнении работ по созданию кандидатного лекарственного средства.

5 Пути и способы достижения заявленных результатов, ограничения и риски
В ходе выполнения проекта предполагается решить следующие задачи:
1 Разработать технологический процесс получения рекомбинантного штамма вируса осповакцины, содержащего двойную встройку генов: гена гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) человека и гена противоопухолевого белка лактаптина, и обладающего иммуностимулирующей и апоптоз-индуцирующей противоопухолевой активностью.
Все рекомбинантные варианты вируса будут получены на основе штамма Л-ИВП VACV, который имеет хорошую многолетнюю медицинскую историю применения, что будет способствовать облегчению условий проведения клинических испытаний препаратов на его основе.
Этапы проведения работ:
1.1 Подготовка ранее полученного авторами проекта рекомбинантного варианта VACV, штамм Л-ИВП, несущего встройку полноразмерной копии кДНК с матричной РНК ГМ-КСФ человека в структурной части гена вирусной тимидинкиназы (ТК).
Подготовка будет включать: наработку штамма на клетках 4647, аттестованных для производства вакцин в России; очистку вируса в градиенте плотности сахарозы (25-46%); титрование и Вестерн-блот для подтверждения экспрессии и секреции ГМ-КСФ.
1.2 Конструирование инсерционных векторных плазмид для получения делеционных по гену вирусного ростового фактора вариантов вируса осповакцины и для встройки вместо делетированного участка трансгена лактаптина.
1.3 Получение рекомбинантных вариантов VACV, несущих встройку гена ГМ-КСФ в ТК-гене и разные формы лактаптина в VGF гене.
1.4 Препаративная наработка, очистка и характеризация отобранных продуцирующих лактаптин клонов вируса.
1.5 Разработка лабораторного регламент получения рекомбинантного вируса осповакцины со встройкой генов ГМ-КСФ и лактаптина.

2 Провести испытания цитотоксической активности полученного рекомбинантного штамма осповакцины на культурах раковых клеток и нормальных клеток человека in vitro (раки молочной железы эстроген-зависимый и эстроген-независимый, карцинома легких).
Этапы проведения работ:
2.1 Подбор и постановка культивирования культур раковых клеток человека и нормальной культуры клеток эпителия молочной железы человека для сравнительного анализа.
2.2 Оценка онколитической активности рекомбинантного вируса на раковых культурах клеток путем определения 50%-ной цитотоксической дозы (ИК50).
2.3 Сравнительный анализ ИКД50 рекомбинантного вируса для раковых и нормальных клеток и отбор раковых клеток, для которых онколитический эффект выражен наиболее сильно с целью дальнейшей оценки in vivo на экспериментальных животных.

3. Провести испытания противоопухолевой активности полученного рекомбинантного штамма осповакцины на опухолевой модели рака молочной железы in vivo.
Этапы проведения работ:
3.1 Подбор и/или закупка экспериментальных животных. Разработка метода прививки клеток опухоли молочной железы человека иммунодефицитным мышам и оценка динамики роста ксенографтов как моделей опухолей человека.
3.2 Подбор оптимальной схемы введения вирусного препарата. Измерение размера опухоли и количества метастазов при разных способах введения вирусного препарата.
3.3 Анализ органов экспериментальных животных на наличие патологических изменений в динамике после введения вируса, с целью определения диссеминации вируса в организме.
3.4 Иммуногистохимический анализ фрагментов опухоли и лимфоузлов в динамике не менее чем в двух временных точках после введения вируса, с использованием маркеров клеточного деления и апоптоза.
3.5 Электронно-микроскопический анализ фрагментов опухоли и прилегающих здоровых тканей с целью подтверждения адресности репликации вируса.
3.6 Заключение о перспективности использования рекомбинантного штамма вируса осповакцины, продуцирующего ГМ-КСФ и лактаптин в онкотерапии.

4. Провести испытания острой токсичности полученного рекомбинантного штамма осповакцины на лабораторных животных согласно «Руководству по проведению доклинических исследований лекарственных средств».

Основными рисками проекта могут являться:
1. В связи со сложной структурой апоптоз-индуцирующего белка лактаптина (большое количество пролинов в первичной структуре молекулы) может быть затруднена или невозможна секреция лактаптина через клеточную мембрану.
2. Введение гена лактаптина в геном вируса осповакцины может повлиять на цитотоксические свойства белка как в сторону увеличения, так и в сторону уменьшения ИК50.









Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
1 Описание областей применения планируемых результатов
Полученные в результате выполнения проекта научно-технические результаты могут быть использованы в фундаментальных и прикладных исследования, а также при производстве лекарственных средств и в практическом здравоохранении:
- методика конструирования инсерционных плазмид, обеспечивающих встройку необходимых генов в геном осповакцины, и методика получения рекомбинантного штамма вируса осповакцины, содержащего две встройки генетического материала, могут быть использовании при создании рекомбинантных вариантов различных вирусов с заданными свойствами.
- полученный рекомбинантный штамм вируса, обладающий одновременно иммуномодулирующими и противоопухолевыми свойствами, может являться основой для создания фармацевтических субстанций и готовых лекарственных форм.
Результаты исследований, безусловно, будут являться патентоспособными:
- введение в геном онколитического вируса одновременно двух генов, продукты которых способны взаимно усиливать противоопухолевое действие друг друга (лактаптина, индуцирующий апоптоз-опухолевых клеток и иммуностимулирующий белок ГМ-КСФ), впервые применяется при разработке противоопухолевых лекарственных средств;
- способы (схемы) терапии злокачесвенных новобразований молочной железы человека разработанным кандидатным лекарственным средством также будут являться объектом патентования.
Результаты проекта будут востребованы исследовательскими организациями, биотехнологическими компаниями, разрабатывающими новые противоопухолевые препараты, фармацевтическими компаниями, которые занимаются производством противоопухолевых терапевтических средств, и организациями практического здравоохранения для терапии злокачественных новообразований и улучшения качества жизни онкологических больных.

2 Описание практического внедрения планируемых результатов или перспектив их использования
Основным потребителем результатов проекта будет являться Индустриальный партнер проекта ООО «Фабрика биополимеров», обеспечивающий 100% внебюджетного финансирования работ по проекту.
ООО «Фабрика биополимеров» - инновационное предприятие, созданное для организации производства биотехнологических лекарственных препаратов (рекомбинантных белков, моноклональных антител, цитокинов, ферментов), в том числе противоопухолевых препаратов на основе лактаптина и его аналогов. Предприятие создано холдингом ООО «ФармЭко» (предприятие ООО «ИРВИН-2», входящее в холдинг, является владельцем 51% доли уставного капитала) и ИХБФМ СО РАН (40% доли уставного капитала) в соответствии с ФЗ 217.
ООО «Фабрика биополимеров» имеет опытный участок для производства биотехнологических лекарственных препаратов, спроектированный и оснащенный согласно стандартам GMP.
Исполнители проекта будут проводить разработку и апробацию Лабораторного регламента получения кандидатного противоопухолевого лекарственного средства на основе рекомбинантного вируса осповакцины и апоптоз-индуцирующего белка лактаптина на опытном участке ООО «Фабрика биополимеров». На этом же участке планируется производство разработанного лекарственного средства для проведения доклинических и клинических исследований.

3 Оценка или прогноз влияния планируемых результатов на развитие научно-технических и технологических направлений
Результаты проекта будут востребованы исследовательскими организациями, биотехнологическими компаниями, разрабатывающими новые противоопухолевые препараты, фармацевтическими компаниями, которые занимаются производством противоопухолевых терапевтических средств, и организациями практического здравоохранения для терапии злокачественных новообразований и улучшения качества жизни онкологических больных.








Текущие результаты проекта:
1 Проведен аналитический обзор информационных источников, затрагивающих научно-техническую проблему, исследуемую в рамках ПНИ.
Аналитический обзор по проекту посвящен проблемам создания противоопухолевых препаратов на основе природных белков и пептидов, способных вызывать апоптотическую гибель раковых клеток, и онколитических вирусов, селективно подавляющих рост опухоли. В обзоре подробно рассмотрены природные белки и пептиды с апоптотическим действием, являющиеся основой противоопухолевых препаратов, находящихся как на стадии исследований, так и на различных стадиях доклинических и клинических исследований. Большое внимание уделено рассмотрению использования способности некоторых вирусов избирательно уничтожать опухолевые клетки при создании противоопухолевых лекарств. Особое внимание в обзоре уделено перспективным лекарственным препаратам, объединяющим способность онколитических вирусов селективно уничтожать клетки опухоли и способность природных белков и пептидов индуцировать апоптоз опухолевых клеток.

2 Проведены патентные исследования. Целью настоящих патентных исследований является исследования технического уровня и тенденций развития средств, обеспечивающих профилактику и лечение опухолей, в частности, рака молочной железы. Предметом настоящего патентного поиска (объектом исследования) являются онколитические вирусные векторы, несущие гены ГМ-КСФ и/или пептидов с противоопухолевой активностью рекомбинантные штаммы онколитических вирусов (в том числе вируса осповакцины) с плазмидными векторами, несущими гены ГМ-КСФ и/или пептидов (в том числе пептидов женского молока), обладающие апоптотической активностью к раковым клеткам. В результате выполнения настоящей научно-исследовательской работы могут быть разработаны патентоспособные технические решения, касающиеся рекомбинантного штамма вируса осповакцины с двойной делецией генов тимидинкиназы и ростового фактора и встройкой в делетированные участки генома двух трансгенов – апоптоз-индуцирующего белка лактаптина и ГМ-КСФ человека. Патентный поиск показал, что объект исследования обладает патентной чистотой, т.к. не нарушает действующих патентов Российской Федерации, касающихся рассматриваемого рекомбинантного штамма вируса осповакцины с противоопухолевыми свойствами
3 Разработана методика конструирования и очистки инсерционных плазмид для встройки гена лактаптина в район гена ростового фактора вируса (VGF). Сконструированы плазмиды pVGF-FR2-PE/L-Pat и pVGF-Sign-FR2-PE/L-Pat. Для конструирования плазмид использовался вектор pVGF-PE/L-Pat, содержащий левый и правый фланки гена С11R (кодирующего вирусный фактор роста) ВОВ штамма ЛИВП, синтетический ранний промотор Р7,5 ВОВ, ген устойчивости к пуромицину под контролем синтетического ранне-позднего промотора PE/L и полилинкер. Селективный маркер - ген устойчивости к ампициллину.
Описание клонируемой последовательности ДНК:
1. Сконструирована последовательность, содержащая левый и правый фланки гена С11R (кодирующего вирусный фактор роста) ВОВ штамма ЛИВП, ген устойчивости к пуромицину под контролем синтетического ранне-позднего промотора PE/L ВОВ (для отбора рекомбинантов ВОВ), синтетический ранний промотор Р7,5К ВОВ и ген лактаптина (FR2).
2. Экспрессия гена лактаптина осуществляется под контролем раннего промотора Р7,5К ВОВ. Физическая карта плазмиды pVGF-FR2-PE/L-Pat показана на Рис.2.
3. Метод, использованный для идентификации клонируемой последовательности - секвенирование ДНК по Сэнгеру.
4. Клонируемый ген лактаптина окружен последовательностями ВОВ, содержащими фланки гена С11R ВОВ штамма ЛИВП для последующей гомологичной рекомбинации, приводящей к делеции гена С11R и встройке гена лактаптина.
5. Способ введения конструкции в прокариотической системе - трансформация клеток Escherichia coli плазмидой.
6. Селективный маркер - ген устойчивости к ампициллину.

4 Депонирование и паспортизация полученных инсерционных плазмид
Полученные инсерционные плазмиды задепонированы в Государственной коллекции Роспотребнадзора возбудителей вирусных инфекций, риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» под номерами Р-56 и Р-57. Получены паспорта плазмид и Справки о депонировании.

5 Наработка, очистка и характеризация штамма Л-ИВП вируса осповакцины со встройкой гена гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) человека проведена в ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор».
Проведена препаративная наработка рекомбинантного штамма VV-GMCSF-S1/3 методом роллерного культивирования в клетках почки африканской зеленой мартышки, аттестованных для производства вакцин в России. Проведена очистка и концентрирование вируса методом дифференциального центрифугирования в градиенте плотности сахарозы (25-45%). Полученный очищенный концентрированный препарат рекомбинантного штамма VV-GMCSF-S1/3 является гомогенной вирусной суспензией с титром 109 БОЕ/мл. Генотип и стабильность встройки гена ГМ-КСФ в вирусном препарате была подтверждена методом ПЦР с использованием специфических праймеров на геномную последовательность и сруктурную часть гена ГМ-КСФ.

6 Подтверждение экспрессии и секреции ГМ-КСФ методом Вестерн-блота или иммуноферментным анализом.
Экспрессия гена ГМ-КСФ подтверждена методом Вестерн-блот с использованием поликлональных кроличьих антител, выявляющих все формы ГМ-КСФ человека, включая негликозилированную внутриклеточную и высокогликозилированную секретируемую. С использованием цитокин-зависимых клеток эритролейкоза человека F-1 показано, что полученный очищенный концентрированный рекомбинантный вирус продуцирует секретируемую форму биологически активного ГМ-КСФ человека в клетках млекопитающих на уровне 40 мкг на мл культуральной среды.

7 Подведение итогов этапа и оформление отчетной документации.
Отчетная документация по итогам выполнения работ 1 этапа проекта находится в стадии оформления.

За счет внебюджетных средств:
8 Закупка материалов и оборудования для приготовления культуральных сред для наработки вируса.

Проведена государственная регистрация НИОКР в государственном информационном фонде неопубликованных документов в ФГАНУ "Центр информационных технологий и систем органов исполнительной власти" Регистрационный номер НИОКР 114081520030, дата регистрации 15.08.2014 г.
Информация о проекте размещена на официальном сайте Получателя субсидии в сети интернет по адресу www.niboch.nsc.ru