Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка технологии картирования сайтов метилирования de novo в геноме человека (эпигенетического секвенирования) на автоматических секвенирующих машинах нового поколения (NGS). Разработка сервиса обработки данных по результатам эпигенетического секвенирования

Докладчик: Дегтярев Сергей Харитонович

Должность: заместитель директора по науке ООО "СибЭнзайм", профессор, доктор биологических наук

Цель проекта:
Цели проекта: 1) Разработка нового метода картирования сайтов метилирования de novo 5’-R(5mC)GY-3’/3’-YG(5mC)R-5’ в геноме человека, базирующегося на использовании метилзависимой ДНК-эндонуклеазы GlaI и высокопроизводительных секвенирующих машин нового поколения (NGS-машин). 2) Разработка сервиса обработки данных по картированию сайтов метилирования de novo в геноме человека. Для достижения этих целей требуется решить ряд задач, основными из которых являются: 1) Разработка метода пробоподготовки ДНК для эпигенетического секвенирования на NGS-машинах. Для решения данной задачи должна быть отработана технология гидролиза геномной ДНК метилзависимой эндонуклеазой GlaI, узнающей и расщепляющей сайты 5’-R(5mC)GY-3’/3’-YG(5mC)R-5’ (далее по тексту R(5mC)GY) с образованием тупых концов. Должна быть отработана методика элюции из геля фрагментов ДНК, получаемых после гидролиза GlaI и имеющих размер 50-400 п.н. Должен быть выполнен подбор адаптеров и определены условия лигирования получаемых фрагментов ДНК с адаптером. 2) Получение карт распределения метилированных сайтов R(5mC)GY в препаратах ДНК из клеточной линии фибробластов легких человека L-68 (здоровые клетки) и малигнантных клеточных линий человека Raji, Jurkat, U-937 и HeLa. Клеточные линии являются моделями соответствующих тканей организма в различных состояниях (норма или опухоль) и представляют собой удобный объект для эпигеномного секвенирования и картирования сайтов R(5mC)GY. Для решения данной задачи должны быть проведены экспериментальные исследования на секвенирующей машине нового поколения "MySeq" (Illumina, США), а также, выборочно, на "IonTorrent" (Applied Biosystems, США). 3) Разработка алгоритма обработки данных секвенирования геномной ДНК после гидролиза ферментом GlaI и сравнения получаемых последовательностей фрагментов со структурой генома человека для определения позиций метилированных сайтов R(5mC)GY. 4) Разработка управляющей блок-схемы (worksheet), адаптирующей программное обеспечение CLC Bio/CLC Genomic Workbench для осуществления функций позиционирования и определения сайтов R(5mC)GY в структуре генома человека по данным эпигенетического секвенирования. 5) Разработка формата хранения получаемой информации с целью последующего создания базы данных распределения сайтов R(5mC)GY в геномах клеточных линий человека и в ДНК различных тканей человека в зависимости от пола, возраста и наличия заболеваний.

Основные планируемые результаты проекта:
Основными результатами проекта будут:
1) Технология картирования сайтов R(5mC)GY в геноме человека на автоматических секвенирующих машинах нового поколения (NGS).
2) Набор пробоподготовки ДНК к эпигенетическому секвенированию.
3) Сервис обработки данных по картированию сайтов метилирования de novo R(5mC)GY в геноме человека, включающий:
- адаптированное программное обеспечение для трактовки результатов секвенирования и создания карт сайтов метилирования de novo R(5mC)GY;
- функциональный блок хранения получаемой информации с целью последующего создания базы данных распределения сайтов R(5mC)GY в геномах различных тканей.

Аналогов разрабатываемого комплекса в России и за рубежом нет. Картирование сайтов 5’-R(5mC)GY-3’ в геноме человека является новым применением секвенаторов нового поколения (NGS-машин), используемых для полногеномного секвенирования. Применение фермента GlaI на этапе пробоподготовки и последующее секвенирование полученных фрагментов ДНК позволит создавать карту активных генов.
Фермент GlaI запатентован, производится только в компании «СибЭнзайм» (Новосибирск, Россия) и не имеет аналогов. Технологии применения GlaI (GlaI-ПЦР-анализ, GLAD-ПЦР-анализ) также запатентованы компанией «СибЭнзайм».

Альтернативный подход, – бисульфитное секвенирование, имеет ряд серьезных недостатков - недоконверсия и деградация ДНК, необходимость значительного количества матрицы, многостадийный длительный процесс пробоподготовки (до 12 часов). В связи с этим при определении эпигенома метод бисульфитного секвенирования дает большое количество ошибок и отличается низкой воспроизводимостью результатов. Предлагаемый нами метод прост и лишен этих недостатков:
а) гидролиз происходит полностью и воспроизводим на одних и тех же ДНК матрицах;
б) разрушения ДНК не происходит;
в) происходит анализ только функциональных сайтов метилирования ДНК;
г) позволяет проводить анализ метилирования de novo по сайтам R(5mC)GY не только генов, но и повторов (в частности Alu-повторов);
д) простой процесс пробоподготовки небольшой длительности (<5 часов).

Для выведения на рынок подобного комплекса необходимо пройти стандартный путь по внедрению набора пробоподготовки ДНК к эпигенетическому секвенированию в производство, а именно:
1) проведение ОКР, включающей разработку технической документации, изготовление опытных образцов, испытания опытных образцов, приемку результатов ОКР;
2) постановку на производство, включающую подготовку производства, освоение производства (изготовление установочной серии и квалификационные испытания).

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Области применения результатов проекта:
Эпигенетическая диагностика, персонализированная медицина, поиск новых эпигенетических маркеров, в т. ч. и для онкозаболеваний. В настоящее время стоимость секвенирования на NGS-машинах с каждым годом снижается, что позволит через несколько лет активно применять его на практике для диагностики широкого спектра заболеваний и оценки различных функциональных состояний организма человека. На сегодня геномное секвенирование поставлено на коммерческую основу во многих странах, но только в Китае делаются массовые секвенирования геномов от заказчиков со всего мира (уже исследовано более 50 тыс. образцов ДНК). В России можно организовать аналогичные работы, но по эпигеномному секвенированию и там осуществлять эти работы на коммерческой основе, получив соответствующие лицензии от разработчиков метода. Более того, с организацией такого центра часть заказчиков перейдет к российскому центру, т.к. клиентам выгоднее будет заказывать эпигеномный и геномный анализ в одном месте.
Внедрение в широкую практику эпигенетического картирования и сравнение полученных карт со стандартными диагностическими картами позволит резко снизить человеческие потери в результате поздно диагностированных опасных состояний организма, особенно тех, начальные этапы которых проходят бессимптомно (болезни сердечнососудистой системы, онкозаболевания, некоторые особо опасные инфекции и др.).
Кроме того, в случае обнаружения зарождающейся болезни можно будет подобрать максимально эффективное лечение, основываясь на активности генов, отвечающих за метаболизм медикаментозных препаратов, что снизит время пребывания пациентов в стационарах.

В качестве конечных потребителей можно рассматривать:
1) Российские научно-исследовательские институты, а также частные российские и зарубежные научно-исследовательские центры и компании, заинтересованные в анализе статуса метилирования ДНК, разработке новых методов диагностики наследственных, онкологических и инфекционных заболеваний, основанных на информации, полученной в ходе исследования статуса метилирования генома.
2) Диагностические центры и компании, которые заинтересованы в получении эпигенетических карт конкретных пациентов.

Текущие результаты проекта:
1) Выполнен аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей научно-техническую проблему, исследуемую в рамках ПНИ. Обзор цитирует 60 источников.
2) Проведены патентные исследования по ГОСТ 15.011-96, подтвердившие новизну и перспективность разрабатываемой научно-технической продукции.
3) Проводятся экспериментальные исследования по подготовке проб ДНК для NGS: подбор и синтез адаптеров, ферментных препаратов для фрагментации и лигирования ДНК.
4) Проводятся экспериментальные исследования по отработке технологии гидролиза геномной ДНК клеток фибробластов легкого L-68 ферментом GlaI и элюции из геля не менее 70% фрагментов фрагментов.
5) На стадии доработки находится лабораторный регламент гидролиза геномной ДНК ферментом GlaI и элюции целевых фрагментов, пригодных для эпигенетичесго секвенирования, из геля.
6) Ведется разработка сервиса обработки данных эпигенетического секвенирования.
7) Наработаны ферментные препараты для фрагментации и лигирования ДНК.
8) Ведется разработка технологии картирования сайтов метилирования de novo 5’-R(5mC)GY-3’/3’-YG(5mC)R-5’ в геноме человека (эпигенетического секвенирования).