Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка конъюгированной вакцины нового поколения для обеспечения высокоэффективной профилактики брюшнотифозной инфекции

Докладчик: Шемякин Игорь Георгиевич

Должность: заместитель директора по научной работе, заместитель директора по научной работе

Цель проекта:
1. Задача, которую решает данный проект относится к проблеме биологической безопасности (эпидемического благополучия) населения в условиях глобализации, низкого уровня здравоохранения в ряде сопредельных государств, и интенсивных миграционных потоков. Задачей проекта является создание средства профилактики брюшнотифозной инфекции нового поколения. 2. Результаты проекта будут использованы для создания брюшнотифозной вакцины нового поколения, пригодной для эффективной профилактики инфекции всех возрастных групп населения и индукции длительного и напряжённого иммунитета против возбудителя брюшного тифа. В ходе проекта планируется проанализировать и испытать различные варианты прототипа вакцины, полученные на основе химической модификации компонентов клеточной стенки патогена высокоиммуногенными бактериальными белковыми антигенами.

Основные планируемые результаты проекта:
1. Основными результатами проекта будут:
1) разработка новой стратегии создания полисахаридных конъюгированных вакцин на основе новейших аналитических данных;
2) технология наработки, очистки и анализа протективных свойств Vi-антигена;
3) технология конструирования, наработки и очистки рекомбинантных антигенов-партнёров для конъюгации;
4) создание экспериментального образца конъюгированной брюшнотифозной вакцины, полученного на основе сравнительного анализа протективного эффекта полученных конъюгированных препаратов и их комбинаций;
5) лабораторный регламент для получения конъюгированной брюшнотифозной вакцины, проекты ТУ и технического задания на проведение ОКР по созданию нового типа конъюгированной брюшнотифозной вакцины.
2.Основными характеристиками планируемых результатов и планируемой научной продукции являются следующие:
1) Препараты рекомбинантных белков, используемых при конъюгации, должны обладать не менее 95% чистоты по данным электрофореза и содержать не более 10 IU эндотоксина на 1 мг белка;
2) Эффективность конъюгации Vi-антигена S. typhi с рекомбинантным белковым антигеном-стимулятором иммунного ответа должна составлять не менее 50%;
3) Композиция конъюгированной брюшнотифозной вакцины должна быть нетоксична и апирогенна (суммарный подъём температуры тела кроликов не должен превышать 1,4 оС);
4) Конъюгированная брюшнотифозная вакцина должна стимулировать образование специфических антител (титр антител должен быть выше в 3-4 раза по сравнению с контролем (полисахаридная вакцина)) и протективный эффект (не менее, чем в 3-4 раза).
3. В рамках исследований планируется тестирование новых вариантов белков-носителей для конъюгации, которые обладают не только свойствами классических белковых антигенов, используемых для создания конъюгированных вакцин, но и свойствами активаторов различных ветвей иммунной системы, а также изучение использования комбинаций белковых партнёров с различными свойствами в отношении индукции ветвей иммунной системы и сравнительный анализ протективного иммунитета, развивающегося при иммунизации различными типами и комбинациями конъюгатов.
4. В мире проводится разработка нескольких препаратов конъюгированых брюшнотифозных вакцин. В частности, на протяжении ряда последних лет конъюгированная вакцина на основе Vi-антигена и белкового партнёра разрабатывается в Индии, однако, несмотря на положительные результаты ряда испытаний, иммунный ответ на конъюгаты с классическими белками-носителями может варьировать в значительных пределах, что неприемлемо для вакцины широкого применения. Поэтому в ряде стран, в том числе несколькими группами в США с участием индийских исследователей ведётся разработка нового поколения вакцины, учитывающего недостатки предыдущих вариантов, в том числе, и с использованием новых белковых партнёров для конъюгации. Разрабатываемая авторами проекта технология в целом является исследованием в близком направлении, и находится на мировом уровне.
5. Заявленные результаты будут достигаться за счёт выполнения мероприятий, запланированных в проекте. К основным рискам относится возможность получения препаратов с протективным эффектом на уровне неконъюгированной вакцины. Для снижения данного риска запланировано использование различных белковых носителей с известными свойствами и доказанной эффективностью в отношении активации иммунной системы. Будут также использованы комбинации конъюгатов с различными белковыми носителями. Особое внимание будет уделено разработке методики конъюгации и тестированию результатов, поскольку оптимизация стехиометрия молекул антигена и носителя в составе конъюгата существенно влияет на эффективность индукции протективного ответа.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
1. Результаты, полученные в ходе выполнения проекта будут использоваться в медицине, эпидемиологии и иммунологии для снижения рисков потерь от социально-значимых инфекционных заболеваний.
2. Созданный в ходе выполнения проекта прототип химической конъюгированной брюшнотифозной вакцины будет в дальнейшем адаптироваться к промышленному производству и проходить доклинические и клинические испытания на базе компании "ГРИТВАК" – индустриального партнёра проекта.
3. Разработка и испытания брюшнотифозной конъюгированной вакцины будут первым элементом отечественной технологической платформы по созданию конъюгированных вакцин для профилактики различных бактериальных инфекций. В мире существует целый ряд конъюгированных вакцин, не производящихся в РФ и используемых для профилактики таких широко распространённых инфекций, как менингококковая, стрептококковая, H. influenzae. Целый ряд вакцин, в том числе для профилактики стафилококковых, эшерихиозных, псевдомонадных и других инфекций находится в разработке. Новейшие исследования привели к смене парадигмы, описывающей механизм действия конъюгированных вакцин, что привело к значительному росту объёма работ в данной области. Создание отечественной платформы для разработки и испытаний конъюгированных вакцин окажет влияние как на развитие фундаментальной иммунологии патогенов, так и на расширение инновационных производств импортозамещающих и полностью новых иммунобиологических препаратов, в том числе экспортно-ориентированных. Научные и клинические данные, полученные в ходе выполнения работ в данной области, несомненно, расширят базу для международного сотрудничества. Информация о новых вакцинах, разработанных в РФ будет способствовать популяризации российской науки и медицинской биотехнологии.

Текущие результаты проекта:
На этапе I выполнения проекта проведен аналитический обзор информационных источников, обоснование и выбор методов и средств, направления исследований и способов получения вакцинных конъюгатов на основе рекомбинантных белков- стимуляторов иммунного ответа.
Проведено теоретическое исследование путей создания вакцины, основанной на применении рекомбинантных белков- стимуляторов иммунного ответа (теоретическое обоснование отбора белков- партнёров для создания конъюгатной вакцины, дизайн последовательностей, кодирующих белковые антигены-партнёры для конъюгации с учётом кодонной оптимизации трансляции и обеспечения эффективной технологии очистки рекомбинантного белкового антигена- партнёра).
Получено 2 серии препарата (5 и 7) Vi-антигена S.typhi массой 100 и 120 мг, соответственно. Составлена лабораторная методика наработки и очистки Vi-антигена S.typhi.
Проведено изучение физико-химических характеристик Vi-антигена S.typhi. Количество примесей белков (по Бредфорд) и нуклеиновых кислот (по Спирину) в полученных образцах Vi-антигена S.typhi не превышало 1% и 2%, соответственно. Согласно данным, полученным с помощью 13С-ЯМР спектроскопии, обе серии Vi-антигена S.typhi содержат не менее 1 мкм иммунодоминантных О-ацетильных групп на 1 мг сухого препарата. Подлинность полученных препаратов Vi-антигена S.typhi была определена в реакции преципитации в геле по Оухтерлони: обе серии Vi-антигена S.typhi в концентрации 50 мкг/мл образовывали дугу преципитации, идентичную референс-препарату Vi-антигена S.typhi. Специфическая активность 5 и 7 серий Vi-антигена S.typhi была подтверждена с помощью ракетного иммуноэлектрофореза: пики преципитации, «ракеты» для обоих препаратов были сопоставимы по высоте с референс-перпаратом Vi-антигена S.typhi. При проверке пирогенности in vivo 5 и 7 серия Vi-антигена S.typhi при введении кроликам в дозе 0,025 мкг/кг не вызывали подъёма температуры ни у одного из трех подопытных кроликов более, чем на 0,6С по сравнению с исходной температурой, а сумма подъемов температур у трех подопытных кроликов не превышала 1,4 С, что соответствует критериям апирогенности.
Проведено экспериментальное исследование иммуногенных и протективных свойств Vi-антигена S. typhi при иммунизации животных. Развитие гуморального иммунного ответа после введения мышам 5 и 7 серий Vi-антигена S.typhi в дозе 25 мкг/мышь оценивали по образованию Vi-специфических антителообразующих клеток (АОК) и антител. Пик АОК у иммунных мышей отмечен на 7 сутки и составил 27,4 АОК на 106 клеток. При изучении Vi-специфического иммунного ответа (иммуногенности 5 и 7 серий Vi-антигена S.typhi), было установлено доминирование продукции анти- Vi антител IgG класса, титры которых превышали титры IgM антител. При исследовании протективных свойств наработанных Vi-антигенов S.typhi было установлено, что оба препарата при внутрибрюшинном введении в диапазоне доз 0,00025 – 25 мкг/мышь обеспечивали 100% выживаемость при заражении мышей S.typhi ТУ2 № 4446 в количестве 1000 клеток/мышь (80 ЛД50). Составлены акты исследований иммуногенных и протективных свойств Vi-антигена S.typhi (2 акта).
Проведены патентные исследования по ГОСТ 15.011-96, направленные на выявление объектов интеллектуальной собственности и периодических публикаций по получению конъюгированных и неконъюгированных вакцин к бактериям рода Salmonella и другим бактериальным патогенам, охватывающие результаты рассмотрения 500 публикаций и краткое описание 30 объектов интеллектуальной собственности по теме исследования. Составлен отчет о патентных исследованиях по ГОСТ 15.011-96.
Подготовлена обзорная статья «Современные представления о механизме активации иммунного ответа конъюгированными полисахаридными вакцинами» (авторы А.В. Колесников, А.В. Козырь, И.Г. Шемякин, И.А.Дятлов).
Внебюджетные средства проекта, предоставленные ФБУН ГНЦ ПМБ и индустриальным партнером компанией "ГРИТВАК", в полном объеме затрачены на материально-техническое обеспечение проекта.