Регистрация / Вход
Прислать материал

Получение персонализированных клеточных препаратов на основе антиген-активированных дендритных клеток и антиген-специфических Т лимфоцитов, предотвращающих рецидив опухоли.

Докладчик: Сенников Сергей Витальевич

Должность: руководитель лаборатории, профессор, доктор медицинских наук

Цель проекта:
Развитие злокачественных новообразований приводит к подавлению иммунного ответа организма (снижение активности Т-лимфоцитов; нарушение механизма презентации опухоль-ассоциированных антигенов на поверхности дендритных клеток лимфоцитам). Ключевая роль в активации противоопухолевого клеточного иммунитета принадлежит дендритным клеткам (ДК). В связи с этим, в настоящее время ведётся активный поиск и разработка современных подходов получения функционально-активных ДК и использование их для стимуляции противоопухолевого иммунного ответа, а также активно разрабатываются различные способы доставки опухолевых антигенов в дендритные клетки в виде лизата опухолевых клеток, пептидов, мРНК, ДНК-конструкций, кодирующих эпитопы опухоль-ассоциированных антигенов, что позволяет создавать на их основе как терапевтические, так и профилактические вакцины. Целью проекта является разработка лабораторного регламента получения клеточных препаратов на основе антиген-активированных дендритных клеток и антиген-специфических Т лимфоцитов для предотвращения рецидива опухоли.

Основные планируемые результаты проекта:
Основные планируемые результаты проекта заключаются в разработке лабораторных регламентов получения клеточного препарата (антиген-активированные дендритные клетки, трансфицированных ДНК-конструкцией, кодирующей основные опухоль-ассоциированные антигены эпителиальных форм злокачественных новообразований и активированные мононуклеарные клетки, антиген-специфические цитотоксические Т-лимфоциты).
Новизна предлагаемых научно-технологических решений заключается в разработке протокола получения клеточных препаратов для персонализированной клеточной иммунотерапии эпителиальных форм онкологических новообразований на основе оригинального протокола культивирования дендритных клеток, который предполагает сократить сроки получения незрелых дендритных клеток и в последующем сократить сроки создания персонализированного клеточного препарата на основе зрелых антиген-активированных дендритных клеток и антиген-специфических Т-клеток. В предлагаемом клеточном протоколе используются не только зрелые антиген-активированные дендритные клетки, но и «обученные» ими in vitro цитотоксические Т-клетки. В аналогах используют только антиген-активированные дендритные клетки, и презентация опухолевых антигенов («обучение») Т-клеткам происходит в организме больного в условиях системной опухоль-опосредованной иммуносупрессии. В рамках проекта предлагается получение обогащенной или «чистой» популяции антигенспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов, обладающих противоопухолевой цитотоксической активностью против клеток рака молочной железы. Этот подход предполагает получение антигенспецифических цитотоксических клеток в культуре, их размножение до количеств, необходимых для клеточной терапии и, собственно, терапию. В этом состоит его основное отличие от предыдущих протоколов и его главное преимущество.
Для достижения заявленных результатов будут получены экспериментальные образцы ДНК-конструкций, кодирующие эпитопы ОАА наиболее специфичных для эпителиальных форм злокачественных новообразований, что, в отличие от аналогов, обеспечит её использование для лечения эпителиальных опухолей различной локализации, и разработана методика доставки ДНК-конструкций в дендритные клетки, суть которой заключается в обеспечении проникновения ДНК-конструкции внутрь дендритных клеток, её считывание и наработка, закодированного белка (по экспрессии белка GFP). Разработанный метод доставки ДНК-конструкций обеспечит необходимое количество дендритных клеток, содержащих и презентирующих эпитопы ОАА. На основе разработанной методики доставки ДНК-конструкций и подходов культивирования дендритных клеток будет разработан лабораторный регламент получения зрелых антиген-активированных дендритных клеток, использование которого позволит культивировать зрелые дендритные клетки. Разработанный лабораторный регламент получения зрелых антиген-активированных дендритных клеток будет, в отличие от ближайших аналогов, иметь меньшую продолжительность по времени при сопоставимой эффективности, что будет являться технологическим преимуществом. Использование полученных зрелых антиген-активированных аутологичных дендритных клеток обеспечит эффективную стимуляцию противоопухолевой цитотоксической иммунной реакции мононуклеарных клеток больных эпителиальными формами злокачественных новообразований.
Направленная активация мононуклеарных клеток против опухолевых клеток будет осуществляться посредством зрелых антиген-активированных дендритных клеток и факторов-регуляторов активности клеточных препаратов. Данный результат будет отличаться от ближайших аналогов комплексной антиген-специфической Тх1-направленной активацией иммунокомпетентных клеток, включающий не только индукцию цитотоксического антиген-специфического клеточного ответа, а также исключение влияния супрессивных факторов на клетки-эффекторы, что в итоге позволит получить максимальный цитотоксический ответ против опухолевых клеток. Этот результат является одним из определяющих достижение цели ПНИ.
Будет разработан лабораторный регламент получения антиген-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов, обладающих противоопухолевой цитотоксической активностью. Этот результат предполагает использование меньшего количества клеток, по сравнению с введением популяции дендритных клеток, или совместной культуры дендритных клеток с мононуклеарными клетками. Сутью этого регламента является новая технология получению популяции антиген-специфических Т-клеток, без активирования поверхностных молекул рецепторов. Предлагается получение обогащенной или «чистой» популяции антиген-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов, обладающих противоопухолевой цитотоксической активностью против клеток рака молочной железы. Этот подход предполагает получение антиген-специфических цитотоксических клеток полностью в культуре и их размножение до количеств, необходимых для клеточной терапии. В этом его основное отличие от ближайших аналогов и главное преимущество. Основной задачей данного регламента является увеличить эффективность антиген-специфической цитотоксической клеточной реакции против опухолевых клеток.
Будет разработан план и в соответствии с ним проведены исследования антиген-активированных дендритных клеток на моделях опухолевой прогрессии у лабораторных животных. В результате будет оптимизирован уровень доставки ДНК-конструкций, кодирующих эпитопы опухоль-ассоциированных антигенов, в дендритные клетки в составе липоплексов, что позволит повысить иммуногенность дендритных клеток. Также будут выявлены оптимальные режимы введения дендритных клеток животным-опухоленосителям, позволяющие получить максимальную регрессию опухоли и метастазов при минимальных побочных иммунологических эффектах.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
На основе разработанных лабораторных регламентов будет разработан проект протокола клинического исследования и оценки эффективности и безопасности противоопухолевой клеточной иммунотерапии пациентов с раком молочной железы, немелкоклеточным раком легких и колоректальным раком, а также проект технического задания на проведение ОТР по теме «Разработка технологий клеточной иммунотерапии больных эпителиальными формами рака». В результате выполнения проекта будут получены новые охраноспособные результаты (патенты, ноу-хау)
Результаты работы могут быть применимы в области персонифицированной медицины в рамках специализированной медицинской помощи как индустриальным партнером (ЗАО «Компания Витамакс»), так и федеральными и региональными медицинскими центрами для широкого применения разработанных подходов клеточной иммунотерапии больных с раком молочной железы, колоректальный рак и немелкоклеточный рак легкого, а также других эпителиальных форм злокачественных новообразований. Помимо этого результаты работы, возможно, применять для вторичной профилактики рецидива онкологического процесса и у пациентов с наследственной предрасположенностью развития эпителиальных форм опухолей. Использование разработанных протоколов для создания клеточных препаратов для профилактики онкологических заболеваний является важным конкурентным преимуществом по сравнению с современными иммунопрепаратами.

Текущие результаты проекта:
Для оценки метода выделения моноцитов адгезией на пластике был проведен сравнительный анализ протоколов данной процедуры с использованием 3 временных режимов и обработкой пластика различными реагентами для усиления адгезивных свойств. По результатам проведенной работы было показано, что наилучший результат, оцениваемый по проценту клеток несущих маркер CD14 в популяции моноцитов определялся в протоколе с обработкой пластика сывороткой человека 4 группы и временем для адгезии 30 минут. Следующий по эффективности был протокол без использования обработки пластика, но с тем же временем инкубации для выделения клеток с высокой адгезивной способностью.
Для отработки методов доставки ДНК-конструкции была использована плазмида, кодирующая зеленый флуоресцентный белок с последующей оценкой на проточном цитометре. Оценка эффективности методов магнитной трансфекции и нуклеофекции с использованием протоколов производителей проводилась на стадии незрелых дендритных клеток после 4 суток инкубации прилипших моноцитов с рекомбинантными цитокинами ГМ-КСФ и ИЛ-4. Используемые параметры позволили получить эффективность трансфекции, оцениваемой по продукции GFP клетками лимфоцитарной популяции 35% для магнитной трансфекции и 47% для нуклеофекции. Полученные результаты являются основанием использования данных методов для введения в дендритные клетки генетического материала, кодирующего эпитопы опухоль-ассоциированных белков, для представления Т-лимфоцитам.
Для оптимизации протокола получения зрелых дендритных клеток был использован клинический материал от больных немелкоклеточным раком легкого, колоректальным раком и раком молочной железы. Для того чтобы эффективно подобрать протокол генерации незрелых и зрелых дендритных клеток были апробированы 14 протоколов, включающих различные сроки инкубации для получения незрелых дендритных клеток, различные стимулы для созревания дендритных клеток и различные сроки инкубации с созревающими стимулами. В ходе проведенной работы были выбраны и оптимизированы протоколы позволяющие достигать значений экспрессии специфических маркеров и костимуляторных молекул в культуре дендритных клеток у больных раком молочной железы и колоректальным раком. Для протокола с использованием материала от больных раком молочной железы были получены данные по проценту клеток CD11c+HLA-DR+ 95%, по проценту клеток CD83+ 60%. При использовании периферической крови от больных колоректальным раком были достигнуты показатели CD11c+HLA-DR+ 85%, CD83+ 62%.
Для отработки методики создания ДНК конструкций, кодирующих эпитопы опухоль-ассоциированных антигенов (ОАА) для различных эпителиальных форм злокачественных новообразований выполнены следующие работы. Выполнен анализ современных научных и информационных источников, затрагивающих научно-техническую проблему, исследуемую в рамках ПНИ, в том числе: обзор научных информационных источников: статьи в ведущих зарубежных и российских научных журналах за период 2009-2014 гг. Разработаны критерии выбора ОАА для решения задачи проекта. Выбраны основные опухоль-ассоциированные антигены с гиперэкспрессией на опухолевых клетках при раке молочной железы, колоректальным раке и немелкоклеточном раке легкого с использованием современных баз данных. Всего выбрано 13 ОАА. Проведена отладка процедуры выбора наиболее эффективных антигенных детерминант, узнаваемые цитотоксическими Т-лимфоцитами, с использованием специализированного программного обеспечения. Выбрано более 500 эпитопов. Проведен теоретический дизайн полиэпитопных иммуногенов с учетом
• оптимизации процессинга,
• протеасомного расщепления,
• включения оптимальных сигнальных последовательностей,
• удаления "паразитных" эпитопов, обусловленных добавлением стыковочных аминокислот в местах соединения эпитопов.
Для оптимизации протокола исследования противоопухолевой активности ДК, нагруженных простыми опухоль-специфическими антигенами, в режиме терапевтической и профилактической схем терапии опухолей у животных и для отработки методов определения Трег в селезенки животных после лечения ДК и методов оценки иммунологического статуса животных после лечения ДК подготовлен аналитический обзор «экспериментальные исследования клеточных препаратов на основе антиген-активированных дендритных клеток в режиме терапевтической и профилактических схем терапии на модельных опухолях животных». Отработан протокол исследования противоопухолевой активности ДК, нагруженных ОАА (суммарная опухолевая РНК) методом липофекции. В профилактической схеме - ДК вакцины вводили однократно за неделю до трансплантации опухоли (для моделей аденокарциномы Кребс-2, карциномы легких Льюис, меланомы В16) или двукратно за 14 дней до трансплантации опухоли с недельным интервалом (для модели меланомы В16); в терапевтической схеме –
ДК вакцины вводили однократно на 4 день развития опухоли (для моделей аденокарциномы Кребс-2, карциномы легких Льюис и меланомы В16) или двукратно, начиная с 4 дня развития опухоли с недельным интервалом (для модели меланомы В16). Показано, что терапевтические ДК вакцины были эффективны для лечения Кребс-2 (падение скорости роста опухоли в 2 раза). Профилактическая ДК вакцина имела сильный антиметастатический потенциал – количество легочных метастазов снижалось в 4,7 и 10 раз в моделях карциномы легких Льюис и меланомы В16, соответственно.
Подготовлена 1 публикация в журнале, индексируемом в базе данных Scopus/Web of Science. Для получения результатов в рамках соглашения было использовано оборудование 2-х Центров коллективного пользования: ЦКП «Клеточные технологии» ФГБНУ «НИИФКИ» и ЦКП «Геномика» СО РАН.