Новые средства для лечения травматических и ишемических повреждений тканей на основе биодеградируемых материалов с иммобилизованными пептидами-агонистами рецепторов, активируемых протеиназами

1. Основной задачей проекта является создание синтетических аналогов эндогенных пептидов-регуляторов воспаления и репарации тканей с цитопротекторными свойствами. Синтезированные препараты должны высокой эффективностью и направленностью действия для купирования острых и хронических воспалительных ответов и эффективного восстановления функций клеток и тканей. Основой таких препаратов могут служить агонисты ПАР1 (ПА-АПС) - индукторы процессов регуляции функций клеток после травматического или ишемического повреждения различных тканей. 2. Создание новых эффективных средств для лечения травматических и ишемических повреждений тканей на основе пептида – агониста рецепторов ПАР1, иммобилизованного в полимерные носители, и разработка оптимальных условий их направленного действия на различные клетки, вовлекаемые в процессы воспаления, нейродегенерации и репарации тканей (in vitro)

1. В результате реализации проекта будет синтезирован новый препарат пептида - агониста ПАР1, освобождаемого АПС (ПА-АПС), иммобилизованный в биосовместимые и биодеградируемые матрицы на основе фиброина шелка. Будет изучено цитопротекторное, противовоспалительное и пролиферативное действие пептида ПА-АРС в моделях воспаления, повреждения клеток in vitro (на культивируемых астроцитах, кератиноцитах и тучных клетках). Для синтезированных препаратов будет исследовано влияние на заживление ран in vitro, на основе анализа его влияния на пролиферацию кератиноцитов и фибробластов после формирования раны клеточного пласта, будет выявлено влияние пептида ПА-АПС на экспрессию факторов роста, белков внеклеточного матрикса, факторов ремоделирования внеклеточного матрикса клетками кожи (кератиноцитами, фибробластами). Будет разработана следующая научно-техническая и конструкторская документация: лабораторный технологический регламент получения экспериментальных образцов иммобилизованного на полимерном носителе пептида - агониста ПАР1, освобождаемого АПС; программа и методика исследовательских испытаний синтезированных экспериментальных образцов иммобилизованного на полимерном носителе пептида - агониста ПАР1, освобождаемого АПС; протоколы и акты исследовательских испытаний экспериментальных образцов.
2. Требования, предъявляемые к разрабатываемому препарату на основе пептида – агониста рецепторов ПАР1, освобождаемого АПС, иммобилизованного на разные формы полимерного носителя:
а) Полимерный носитель должен быть сформирован на основе фиброина шелка; полимерный носитель должен быть представлен в трех формах: покрытие, пленка, трехмерный матрикс; разные формы полимерного носителя должны иметь следующие параметры:
-покрытие: диаметр не менее 24 мм, концентрация фиброина шелка в растворе для синтеза образцов должна составлять не менее 70 мг/мл, толщина слоя не более 200 мкм;
-пленка: линейные размеры не менее 5 мм, концентрация фиброина шелка в растворе для синтеза образцов должна составлять не менее 20 мг/мл, толщина слоя не более 400 мкм;
-трехмерный матрикс: диаметр не менее 3 мм, концентрация фиброина шелка в растворе для синтеза образцов должна составлять не менее 20 мг/мл, толщина слоя не менее 1000 мкм, пористость не менее 90%, диаметр пор не менее 30 мкм и не более 200 мкм.
б) Все формы полимерного носителя должны быть биодеградируемы:
- деградация в нейтральной среде - через 6 недель изменение массы не более чем на 30%; - деградация в окисляющей среде - через 2 недели изменение массы не более чем на 50%; - стабильность при хранении в сухом виде при температуре +4°С – не менее 6 месяцев; - стабильность в водных растворах при температуре +4°С – не менее 3 недель.
в) Полученный препарат на основе пептида – агониста рецепторов ПАР1, освобождаемого АПС, иммобилизованного на разные формы полимерного носителя, должен обладать цитопротекторным, противовоспалительным и пролиферативным действиями.
г) Защитное действие (активность) пептид должен демонстрировать как в нативной, растворённой форме, так и после высвобождения из полимерного носителя.
д) Диапазон эффективных концентраций препарата не должен перекрываться с концентрациями, проявляющими побочные эффекты. Препарат должен демонстрировать максимально эффективное действие в низких концентрациях от наномолярных до микромолярных
3. Используемые методики и технологические решения соответствуют современным научным методам исследований. Для определенных типов исследований проводилась адаптация или модификация используемых методик.
4. Ранее было показано, что иммобилизованный в полимерные матриксы или биодеградабельные микрочастицы пептид-агонист ПАР1, освобождаемый тромбином, может имитировать пролиферативные свойства фермента в процессе регенерации ткани и ускорять заживление ран у мышей и крыс (Strukova et al., 2001, 2002, Markvicheva et al., 2006). Пептиды-агонисты ПАР-1, освобождаемые АПС, являются более дешевыми препаратами, по сравнению с рекомбинантным и модифицированным АПС, однако есть опасность их быстрого расщепляются пептидазами в организме. Иммобилизация пептидов в полимерные матрицы или микрочастицы позволяет защитить пептиды от разрушения, а также направленно регулировать скорость их выхода как в условиях in vitro так и in vivo. В связи с этим особую значимость приобретает правильный выбор полимерной матрицы. Использование полимерных матриц или микрочастиц на основе фиброинов шелка или полисахаридов – альгинатов и др. позволяет получать матрицы, которые являются не только биосовместимыми, но и биодеградируемыми, а, следовательно, могут быть предложены и для направленного лечения и восстановления функций разных клеток и тканей как после травмы и хирургических вмешательств, так и после ишемии мозга и других органов.
5. Для достижения заявленных результатов в начале реализации проекта на основе анализа научно-технической и нормативной документации, а также результатов исследований, выполненных ранее, был проведен обоснованный выбор направления исследований по созданию препаратов на основе пептида – агониста рецепторов ПАР1, освобождаемого АПС, иммобилизованного в полимерные носители. Для достижения результатов в ходе реализации проекта должны быть решены конкретные задачи, исходя из этого выстраивался хронологический порядок проведения работ, были выбраны определенные теоретические и экспериментальные подходы и методы. Экспериментальные исследования будут выполняться с использованием стандартных модельных систем и методик, используемых для проведения исследованиях в данной области (методы работы с клетками млекопитающих, методы микроскопии, биохимические методы), а также модельных систем и методик, ранее разработанных участниками проекта, и модифицированных и адаптированных для выполнения конкретной научной задачи. Для получения достоверных результатов сравнительных исследований эксперименты по изучению функциональной активности пептида до и после иммобилизации будут проводится в одинаковых условиях, с использованием отработанных на начальных этапах модельных систем и методик. Анализ полученных данных позволит определить влияние иммобилизации на функциональную активность препарата, что позволит сделать прогнозные предположения о дальнейшем развитии проекта и полученных результатов.

1. Область применения планируемых результатов - Медицина и здравоохранение.
2. Так как целью проекта является создание новых эффективных средств для лечения травматических и ишемических повреждений тканей, то результатами проекта могут заинтересоваться лаборатории и институты, деятельность которых связана непосредственно с разработкой, лабораторными и доклиническими испытаниями лекарственных препаратов и изделий медицинского назначения. К  таким организациям например можно отнести Научно-исследовательский инновационный центр «Разработка и регистрация лекарственных средств».  Своей целью центр ставит разработку и производство отечественной конкурентоспособной продукции, а также участие в осуществлении прикладных исследований и разработок, позволяющих выводить на рынок инновационные лекарственные средства. Так же при анализе возможных потребителей ожидаемых результатов проекта была найдена информация о закрытом акционерном обществе "Сибирский Центр фармакологии и биотехнологии", в соответствии с информацией, содержащейся на официальном сайте,  Сибирский центр фармакологии и биотехнологии является частью холдинга SFM, он объединяет в себе более 10 компаний фармацевтической направленности и имеет полную сквозную бизнес-цепочку, начиная от разработки новых молекул до поставки готового продукта потребителю. Сибирский центр фармакологии и биотехнологии производит препараты на основе молекулярных биотехнологий. "Примером таких соединений являются новые классы иммобилизованных препаратов Сибирского центра фармакологии и биотехнологии. Фактически, это новое направление в разработке лекарственных препаратов,  В молекулярную структуру препарата входят два компонента, а именно действующее вещество и матрица-носитель. Этот носитель доставляет нужное вещество непосредственно к тому месту, где оно будет востребовано в обход естественных препятствий, которые возникают у него на пути.
3. Полученная в результате реализации заявляемого проекта научно-техническая, патентная и конструкторская документация, а также результаты экспериментальных исследований и испытаний синтезированных образцов будут востребованы при переводе проекта на следующую стадию жизненного цикла - НИОКР или ОКР. В дальнейшем результаты данной работы и созданная технология могут быть использованы для создания лекарственных препаратов нового поколения, как в нашей стране, так и за рубежом. Создаваемая технология может быть востребована как научно-исследовательскими центрами, так и фармацевтическими компаниями, ведущими исследования в области создания новых медицинских средств. Полученные данные могут быть также использованы для корректировки направлений целевых программ по созданию лекарственных средств нового поколения

В начале реализации проекта на основе анализа научно-технической и нормативной документации, а также результатов исследований, выполненных ранее, был проведен обоснованный выбор направления исследований по созданию препаратов на основе пептида – агониста рецепторов ПАР1, освобождаемого АПС, иммобилизованного в полимерные носители. Для достижения результатов в ходе реализации проекта должны быть решены конкретные задачи, исходя из этого выстраивался хронологический порядок проведения работ, были выбраны определенные теоретические и экспериментальные подходы и методы. Анализ полученных данных позволит определить влияние иммобилизации на функциональную активность препарата, что позволит сделать прогнозные предположения о дальнейшем развитии проекта и полученных результатов.
Для выполнения задач проекта была оптимизирована методика синтеза пептида – агониста рецепторов ПАР1, освобождаемого АПС. Разработанная методика предназначена для химического синтеза биологически активного агониста рецептора ПАР1 - пептида ПА-АПС. Примененные методы синтеза, деблокирования, очистки и модификации пептидов позволили быстро и с высоким выходами получить пептид – агонист рецепторов ПАР1, освобождаемого АПС, и его меченный аналог в следующих количествах: 100 мг пептида – агониста рецепторов ПАР1, освобождаемого АПС и 30 мг пептида – агониста рецепторов ПАР1, освобождаемого АПС, конъюгированного с флуоресцентной меткой.
На основе анализа полученных ранее данных, а также используя экспериментальные методы и подходы, был определен состав, способы формирования и параметры всех трёх типов полимерных носителей:
- образцы покрытий формировали из раствора фиброина, содержание белка в растворе 70 мг/мл. Для формирования покрытия раствор фиброина наносили на поверхность подложки и высушивали.
-образцы пленок формировали методом кастинга из раствора фиброина, содержание белка в растворе 20 мг/мл. Для формирования пленок раствор фиброина наносили на тефлон и высушивали.
-образцы трехмерных матриксов формировали методом замораживания-оттаивания из раствора фиброина, концентрация фиброина шелка в растворе составляла 20 мг/мл. После формирования все образцы помещали в 90% этанол на 60 минут, далее высушивали и хранили при температуре +4 С˚.