Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка тест-систем для идентификации структурных перестроек генома опухолевых клеток и молекулярно-генетических характеристик пациента, определяющих выбор терапии и прогноз при острых лейкозах у детей

Докладчик: Наседкина Татьяна Васильевна

Должность: ведущий научный сотрудник

Цель проекта:
Проект направлен на разработку методов идентификации молекулярно-генетических маркеров, определяющих выбор персонифицированной терапии (лекарственной и трансплантационной) при острых лейкозах у детей. В результате выполнения проекта будут разработаны две тест-системы: 1) тест-система для выявления структурных перестроек генома, приводящих к образованию химерных генов в опухолевых клетках и 2) тест-система для определения полиморфных маркеров в генах метаболизирующих ферментов и генах иммунного ответа, ассоциированных с ответом на лечение.

Основные планируемые результаты проекта:
В результате выполнения проекта будут получены новые данные по частотам и спектру структурных перестроек генома при острых лейкозах у детей в России. Будут разработаны методы для идентификации клинически значимых структурных перестроек (химерных генов) в опухолевых клетках кроветворной системы. По результатам исследований будет разработан и испытан макет тест-системы для идентификации не менее 22 клинически значимых перестроек в клинических образцах пациентов с различными формами лейкозов.
Будут выявлены клинически значимые мутации и полиморфизмы в генах метаболизма лекарственных препаратов и генах врожденного иммунного ответа, определяющие чувствительность к терапии и риск развития тяжелых осложнений. Будет разработан макет тест-системы для идентификации выбранных молекулярно-генетических маркеров у детей с острыми лейкозами на основе методов многопараметрического анализа и проведены экспериментальные испытания.
Будут получены следующие научно-технические результаты:
— отдельные технические и технологические решения по созданию новых видов продукции и способов производства (технологий);
1) Промежуточные и заключительный отчеты о ПНИ, содержащие:а) анализ научно-технической литературы, нормативно-технической документации и других материалов, относящихся к разрабатываемой теме; б) обоснование выбора направления исследований;в) результаты анализа данных экспериментальных исследований; г) обобщение и выводы по результатам ПНИ.
2) Отчет о патентных исследованиях, оформленный в соответствии с ГОСТ 15.011-96.
3) Заявки на получение правоохранных документов объектов интеллектуальной собственности.
4) Макеты тест-систем для индивидуализации лекарственной и трансплантационной терапии острых лейкозов у детей на основе идентификации генетических нарушений в опухолевых клетках и определения молекулярно-генетических характеристик пациента:
-макет тест-системы для идентификации структурных перестроек генома (химерных генов) в опухолевых клетках;
-макет тест-системы для идентификации полиморфных маркеров в генах метаболизма лекарственных препаратов и генах иммунного ответа (фармако- и иммуногенетический профили пациента).
5) Методики идентификации молекулярно-генетических маркеров для повышения точности дифференциальной диагностики лейкозов, разделения на группы риска, повышения эффективности терапии и снижения частоты побочных реакций:
-методика идентификации структурных перестроек генома (химерных генов) для повышения точности дифференциальной диагностики лейкозов и разделения на группы риска;
-методика идентификации полиморфных маркеров в генах метаболизма лекарственных препаратов и генах иммунного ответа для повышения эффективности терапии и снижения частоты побочных реакций:
6) Техническая документация на разрабатываемые тест-системы:
-эскизная конструкторская документация (на каждый макет тест-системы) в составе Пояснительной записки (ПЗ), Программы и методики испытаний (ПМ), Ведомости эскизного проекта (ВЭ).
-лабораторный технологический регламент на изготовление макетов тест-систем (на каждую тест-систему).
7) Технические требования и предложения по разработке, производству и эксплуатации продукции с учетом технологических возможностей и особенностей индустриального партнера - организации реального сектора экономики.
8)Проект технического задания на проведение ОКРпо теме: «Разработка и постановка на производство диагностических тест-систем для идентификации структурных перестроек генома (химерных генов) и полиморфных маркеров в генах метаболизма лекарственных препаратов и генах иммунного ответа для индивидуализации терапии при острых лейкозах у детей».
В результате выполнения проекта будут созданы прототипы новых диагностических инструментов, способные повысить эффективность молекулярно-генетической диагностики острых лейкозов у детей. В свою очередь это будет способствовать разработке и внедрению персонифицированных подходов к лечению, повышению эффективности лечения и снижению смертности от заболевания.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Основной областью практического применения результатов работ является онкогематология. Современная детская онкогематология представляет собой высокотехнологичную область медицины. Лечение больных детей в России проводится на уровне мировых стандартов с использованием последних достижений науки и медицинской практики. Современные протоколы лечения лейкозов у детей основаны на разделении пациентов на группы риска в соответствии с клиническими показателями и молекулярно-генетическими особенностями опухолевых клеток. Поиск и идентификация молекулярно-генетических факторов, позволяющих проводить более точную молекулярную диагностику заболевания, уточнять прогноз и оптимизировать выбор терапии, а также разработка тест-систем для клинического применения может существенно повысить эффективность лечения и улучшить показатели выживаемости у пациентов с острыми лейкозами.
В первую очередь, научные результаты настоящего проекта будут востребованы в Федеральном научно-клиническом центре детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева.ФНКЦ ДГОИ им. Дм. Рогачева - многопрофильное медицинское учреждение, в котором оказывают специализированную помощь детям с онкологическими и гематологическими заболеваниями. В настоящее время, в ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева используется разработанный ранее в ИМБ РАН набор реагентов ЛК-Биочип для выявления 12 клинически значимых транслокаций при лейкозах у детей. ФНКЦ ДГОИ им. Дм. Рогачева является ведущим медицинским учреждением в нашей стране в области детской гематологии, на базе Центра разрабатываются новые стандарты диагностики и лечения онкогематологических больных, проводится молекулярно-генетическая диагностика для больных из региональных отделений и клиник. В диагностике лейкозов используется совокупность подходов, методы молекулярно-генетического анализа являются необходимым этапом клинической лабораторной диагностики лейкозов. Разрабатываемые в настоящем проекте тест-системы имеют ряд преимуществ по сравнению с другими методами молекулярно-генетического анализа, поэтому их востребованность является достаточно обоснованной. В ФНКЦ ДГОИ им. Дм.Рогачева будут проведены экспериментальные испытания тест-систем, разработаны рекомендации по возможному использованию тест-систем в медицинской практике.
Лечение онкологических больных является дорогостоящим и часто связано с высоким риском развития угрожающих жизни состояний в ходе самого лечения. Поэтому научно-обоснованный выбор терапии позволяет рационально использовать финансовые средства, выделяемые на лечение, уменьшить риск развития тяжелых побочных реакций, и тем самым повысить эффективность лечения и снизить смертность у детей с онкологическими заболеваниями.

Текущие результаты проекта:
Проведен аналитический обзор научных и информационных источников по теме проекта. Проведены патентные исследования. С использованием баз данных GenBank и Ensembl проанализированы последовательности генов ETV6, TCF3-PBX1, BCR, MLL, PML, RUNX1, CBFB, PBX1, ABL1, AF4, RARA, RUNX1T1, MYH11, MLLT3, MLLT10 и др., а также химерных генов с их участием: t(12;21)ETV6-RUNX1, t(1;19)TCF3-PBX1, t(9;22)BCR-ABL1, t(4;11)MLL-AF4, t(15;17)PML-RARA, t(8;21)RUNX1-RUNX1T1, inv(16)CBFBMYH11, t(9;11)MLL-MLLT3, t(10;11)MLL-MLLT10. Для выбора способа идентификации вышеперечисленных структурных перестроек, проанализированы возможные варианты решения этой задачи, с учётом специфики идентифицируемых последовательностей. В качестве наиболее оптимального способа
выбран гибридизационный анализ на биочипе с предварительной пробоподготовкой в виде обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) на тотальной РНК, выделенной из костного мозга больных лейкозом. Разработана методика одностадийной ПЦР с использованием флуоресцентно-меченных дезоксинуклеозидтрифосфатов для маркирования химерных ПЦР-продуктов. Подобраны специфичные праймеры для этапа обратной транскрипции и получения химерной кДНК. Для проведения одностадийной ПЦР подобраны последовательности комбинированных праймеров, содержащих участки, специфичные для химерных генов, и участки с универсальной последовательностью. Проведена оптимизация условий мультиплексной ПЦР. Разработана панель наиболее информативных маркеров опухолевых клеток на основе химерных генов (не менее 22), определяющих различные подтипы заболевания, выбор терапии и прогноз детей с острыми лейкозами.
Сформирована коллекция клинического материала, включающая 100 образцов костного мозга детей, больных лейкозами. Критериями включения являются: впервые поставленный диагноз острого лейкоза (ОЛЛ или ОМЛ), отсутствие лечения на момент взятия материала костного мозга, возраст от 0 до 18 лет. Для образцов коллекции проведено цитогенетическое исследование, определение иммунофенотипа. Проведен поиск редких перестроек (химерных генов) с участием гена MLL с использованием флуоресцентной гибридизации in situ. В двух образцах с выявленной перестройкой гена MLL проведена идентификация генов-партнеров, вовлеченных в перестройки, с использованием метода LDI-ПЦР и последующего секвенирования. Проведена экспериментальная проверка специфичности комплементарного взаимодействия иммобилизованных олигонуклеотидных зондов на биочипе и флуоресцентно-меченых ДНК-мишеней при определении вариантов слияния генов.