Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка мультиплексных электрохимических сенсорных систем на основе наночастиц благородных металлов и ДНК-аптамеров для диагностики рака легкого.

Докладчик: Замай Сергей Сергеевич

Должность: ведущий технолог, к.ф.-м.н.

Цель проекта:
1. Проблема. Актуальная, особенно на ранних стадиях, диагностика рака легкого, не имеет инструментального и методического обеспечения, позволяющего осуществлять неинвазивное, точное и оперативное определение типа заболевания на основе анализа микрообъемов образцов биологических жидкостей. 2. Цель. Разработка мультиплексных электрохимических сенсорных систем, предназначенных для одновременного и оперативного определения в биологических жидкостях концентрации комплекса белков-биомаркеров онкологических заболеваний и их апробация на примерах задач диагностики рака легких человека по анализам интактной крови.

Основные планируемые результаты проекта:
Краткое описание основных результатов
1. Экспериментальные образцы электрохимических сенсорных систем на основе синтетических аналогов антител для определения концентрации белков-биомаркеров (согласно перечню п. 4.1.2) в биообразцах онкобольных;
2. Лабораторный регламент изготовления сенсорных систем;
3. Методика определения концентрации белков в биообразцах с помощью разработанной сенсорной системы;
4. Технические требования и предложения по разработке, производству и эксплуатации продукции с учетом технологических возможностей и особенностей индустриального партнера – организации реального сектора экономики.
5. Дополнительно к традиционно используемым в диагностике рака легкого перечень новых белков-биомаркеров – мишеней ДНК-аптамеров.
6. Патент на полезную модель получения одноразовых электрохимических биочипов, предназначенных для измерения концентрации белков-биомаркеров рака легкого в биологических жидкостях.
7. Патент на способ диагностики рака легкого с помощью мультиплексных электрохимических сенсорных систем для определения концентрации белков-биомаркеров в биологических жидкостях.
8. Проект технического задания по теме: «Опытно-технологическая разработка производства одноразовых электрохимических биочипов, предназначенных для измерения концентрации белков-биомаркеров рака легкого в биологических образцах.
9. Проект технического задания на проведение ОКР по теме: «Опытно-технологическая разработка аппаратно-программного и методического обеспечения использования сенсорной системы, как медицинского изделия, предназначенного для диагностики онкологических заболеваний и исследования его биомедицинской эффективности на примерах использования электрохимических биочипов для измерения концентрации белков-биомаркеров рака легкого».

В последние несколько лет, аптамеры стали рассматривать как новый класс лигандов, обладающих существенными преимуществами перед мооклональными антителами для диагностики и терапии рака (Hu M., 2013; Sefah K., 2013). Объединив физико-химические функциональные возможности специально подобранных молекул и новых наноматериалов с уникальными свойствами к селективному распознаванию ДНК-аптамеров, можно создать новые медицинские изделия и стратегии в борьбе онкологическими заболеваниями. (Liu Q. , 2014; Chen T., 2011).

Решение задачи создания мультиплексных электрохимических сенсорных систем, предназначенных для определения концентрации белков-онкомаркеров с подтвержденной эффективность на «in vitro» и «in vivo» экспериментальных и теоретических моделях злокачественных новообразований легкого человека, позволит использовать полученные фундаментальные знания, методы и модели биомедицинских исследований и технологии для разработки широкого класса средств диагностики онкологических заболеваний.

Выбор аптамеров основан на скрининге большого числа последовательностей в библиотеках in vitro c помощью технологии SELEX (систематическое выделение лигандов экспоненциальным обогащением). По сравнению с традиционными лигандами, в том числе, антителами, пептидами и малыми молекулами, аптамеры имеют ряд преимуществ, таких как малая стоимость, низкие иммуногенность и токсичность, возможность практически любой химической модификации, стабильность, возможность воостановления свойств при их потере, небольшие размеры, позволяющие проникновение в опухоли и высокое сродство для связывания с мишенью (Ulrich H., 2006, Muharemajic D., 2013). Все это делает аптамеры практически идеальными кандидатами для создания на их основе препаратов диагностики онкологических заболеваний. Наши исследования также показали высокую эффективность аптамеров (Kolovskaya O., 2013, Zamay A., 2014), комплексов аптамеров с полисахаридами (Zamay T., 2014) и мультимерных конструкций на основе аптамеров (Muharemajic D., 2014), которые могут быть использованы для диагностики (Labib M., 2012; Labib M., 2013, Muharemajic D., 2013; Kolovskaya O., 2014; Zamay T., 2014).

У коллектива имеется значительный опыт в области синтеза наночастиц золота, серебра, меди, в т.ч. анизотропных (нанопризм, наностержней), с регулируемыми геометрическими параметрами и свойствами, и изучения наночастиц, в том числе, иммобилизованнных на различных подложках, а также широкого круга поверхности других материалов методами РФЭС, рентгеновской спектроскопии поглощения (EXAFS, XANES). При изучении механизма образования наночастиц золота и сульфида золота при цитратном и сульфидном восстановлении динамического рассеяния света (DLS) обнаружены с использованием методов in situ АСМ, малоуглового рентгеновского рассеяния (SAXS), в т.ч. с синхротронным возбуждением, квазижидкие интермедиаты и предложен новый неклассический механизм нуклеации и роста наночастиц.

Коллектив имеет опыт селекции аптамеров к различным мишеням: клеткам и тканям [Замай О.С., 2011; Замай Г.С., 2012], бактериям [Замай Т.Н., 2012; Labib M., 2012], вирусам [Labib M., Zamay A.S., 2012], антителам [Muharemagic D., 2012], а также определения их биологического эффекта [Zamay A., 2012]. В результате проведенных ранее научно-исследовательских работ нами были получены аптамеры к опухолевой ткани легкого человека. Исследования показали, что аптамеры способны находить в кровотоке циркулирующие раковые клетки, поэтому с высокой вероятностью должны быть эффективны при диагностике рака легкого и его метастаз [Замай Т.Н., 2012]. Кроме того, членами коллектива были получены аптамеры к возбудителям сальмонеллеза, с помощью которых были определены биомаркеры разных серотипов сальмонелл с различной патогенностью и лекарственной устойчивостью, проведено выявление соответствия между биомаркерами различных сальмонелл и последовательностью нуклеотидов в их геномах, разработаны экспериментальные образцы тест-систем на основе аптамеров с помощью проточной цитометрии для идентификации и определения S. enteritidis и S. typhimurium [Замай Т.Н., 2012; Labib M., 2012]. Разработан электрохимический биосенсор для выявления возбудителей сальмонеллеза на основе аптамеров [Labib M., Zamay A., 2012]. Результаты последних двух лет работы научной группы опубликованы в журналах перечня ВАК и зарубежных журналах с высоким импакт-факторами (более 5). Более 10 докладов представлено на международных конференциях молодыми учеными в Канаде, Тайване, Японии, Франции, Италии, Германии, Великобритании. Получен патент на полезную модель «Диагностическая тест-система на основе аптамеров» № 117150. Получены положительные решения на выдачу еще двух патентов РФ. На средства, полученные для выполнения государственного задания по темам «Разработка тест-системы для определения рака легкого человека» и «Разработка тест-системы для определения сальмонеллеза», был приобретен высокоэффективный жидкостный хроматограф и тандемный масс-спектрометр высокого разрешения с линейной и орбитальной ловушками. Создается новая научная группа для решения задач персонифицированной медицины в области протеомики, первые результаты которой были представлены на международных конференциях (Япония, Тайвань, Франция, Италия, Великобритания). Получены предварительные результаты, показывающие возможность идентификации биомаркеров с помощью аптамеров на примере плоскоклеточного рака легкого и аденокарциномы с помощью разрабатываемой нами технологии. Были выявлены наиболее вероятные кандидаты в биомаркеры рака легкого [Замай Г.С., 2012; Kolovskaya O. et al, 2014].

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Назначение
Мультиплексная электрохимическая сенсорная система предназначена для определения концентрации: (1) традиционно исследуемых белков-биомаркеров онкозаболеваний (цитокерататинов, молекул эпительно-клеточной адгезии EpCAM, рецептора урокиназы PLAUR, ингибитора рецептора лимфолейкоза LIFR, предшественника гастрин-рилизинг пептида ProGRP, раково-эмбрионального антигена CEA); (2) концентрации белков-мишеней для высокоаффинных и высокоспецифичных ДНК-аптамеров полученных авторами проекта к опухолевой ткани легкого человека. По результатам научно-клинических исследований она может быть доработана до уровня экспериментального образца медицинского изделия дифференциальной диагностики онкозаболеваний. Перспективы расширения спектра медицинских приложений обеспечиваются возможностями увеличения числа определяемых белков биомаркеров, которое в свою очередь обеспечивается авторскими технологиями получения сменных (одноразовых) мультиплексных электрохимических биочипов и технологии получения ДНК-аптамеров к биомишеням социально-значимых заболеваний.

Области применения, способы использования результатов:
- производство медицинских изделий диагностики онкозаболеваний;
- медицинская диагностика онкозаболеваний, в том числе, ранняя.
- мониторинг терапии онкозаболеваний.

Текущие результаты проекта:
1. Проведен анализ научно-технической и методической литературы, относящейся к разрабатываемой теме, в том числе описаны свойства золотых наночастиц, их синтез и применение в диагностических целях, охарактеризованы оптические биосенсоры на основе золотых наночастиц и электрохимически биосенсоры на основе золотых наночастиц.
2. Описана полярографическая вольтамперометрия и измерительное устройство для вольтамперометрической полярографии, способное регистрировать взаимодействие аптамер-мишень на поверхности электрода.
3. Проведены патентные исследований, показавшие, что разрабатываемая мультиплексная система обладает значительным преимуществом по сравнению с известными аналогами, поскольку будут предлагаться не только непосредственно методы детекции, но и последовательности специфичных ДНК-аптамеров, в результате чего продукт будет являться более завершенным, готовым для внедрению в клиническую практику.
4. На основании аналитического обзора и патентных исследований обоснованы выбор направления исследований, методов и средств изучения структуры мультиплексных биосенсоров.
5. Выбраны наиболее аффинные и специфичные ДНК-аптамеры, полученные к опухолевой ткани легких с использованием послеоперационного материала, комплементарные специфичным для рака легкого белкам-биомаркерам.
6. Разработаны молекулярные биосенсоры, получаемые посредством модификации типовых печатных графитовых электродов наночастицами золота диаметром 10 нм и ДНК-аптамерами и нанобиосенсоры, получаемые посредством модификации ДНК-аптамерами в коллоидных растворах наночастиц золота диаметром 10 нм и 40 нм.
7. На образцах плазмы крови больных раком легкого и здоровых людей выполнена оценка селективности нанобиосенсоров (10 нм), используемых для получения электрохимических биочипов.
8. Изучено влияние иммобилизации ДНК-аптамеров на оптические свойства, агрегативную устойчивость золей и электрохимическое поведение наночастиц золота диаметром 10нм и 40 нм.
9. Произведен маркетинг рынка и изучены технологии производства средств медицинской диагностики, использующих электрохимические биочипы, моноклональные и искусственные антитела, наночастицы благородных металлов. Разработаны предложения и схемы логистики получения мультиплексных электрохимических сенсорных систем диагностики.