Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка синтетических подходов к новым биоактивным оксилипинам возможным биомаркерам оксидативного стресса и потенциальным нейрозащитным агентам

Докладчик: Безуглов Владимир Виленович

Должность: заведующий лабораторией, профессор, доктор химических наук

Цель проекта:
Цель проекта – создание научно-практического задела в области липидных биомаркеров оксидативного стресса путём проведения совместных исследований российского и французского партнёра. В задачи проекта входят: 1) разработка оптимизированного синтеза некоторых изо- и нейропростанов в количествах, достаточных для проведения испытаний на моделях с использованием клеточных линий (французский партнер); 2) разработка оптимизированного синтеза дейтерированных аналогов нейропростанов для количественного анализа (французский партнёр); 3) разработка синтеза дофаминамида изопростана E2 в микроколичествах и полупрепаративного синтеза дофаминамида простагландина E2; 4) разработка процедуры определения содержания нейро- и изопростанов, а также дофаминамидов изопростана E2 и простагдандина E2 в биологических образцах; 5) разработка новых производных простагландина E2, содержащих линкер между остатками простагландина и дофамина для изучения их нейрозащитных свойств в сравнении с другими родственными дофаминамидами и выбор активного нейрозащитного агента; 6) оценка биологической активности всех синтезированных соединений в тестах на клеточных культурах и лабораторных животных.

Основные планируемые результаты проекта:
В ходе выполнения проекта предстоит решить три группы задач: химический синтез всех запланированных соединений, оценка биологической активности синтезированных соединений и анализ содержания нейро- и изопростанов и дофаминамидов изопростана E2 и простагдандниа E2 в биологических образцах.
Задачи химического синтеза включают: 1) получение методами полного химического синтеза одного редкого изопростана E2 – продукта свободнорадикального окисления арахидоновой кислоты, двух нейропростанов, происходящих из докозагексаеновой кислоты и их дейтерированных аналогов для использования в качестве внутреннего стандарта при анализе нейропростанов; 2) синтез микроколичеств (0,8 – 1 мг) дофаминамида изопростана E2, что обусловлено малой доступностью исходного изопростана E2 из-за низкого выхода многостадийного химического синтеза, а также синтез дофаминамида простагдандина E2 в полупрепаративном масштабе (до 100 мг за одну загрузку), чтобы обеспечить его достаточное количество для тестирования на животных; 3) синтез новых производных простагландина E2, содержащих молекулярную вставку длиной 2 и 4 углеродных атома между карбоксильной группой простагландина и аминогруппой дофамина, чтобы определить влияние расстояния между остатками дофамина и простагландина на биологические свойства.
Запланировано, что в лаборатории французского партнёра будет проведена оптимизация ранее разработанной в этой лаборатории схемы полного химического синтеза изо- и нейропростанов, что позволит повысить выход целевых соединений. Модификация изопростана E2 присоединением остатка дофамина будет проведена в лаборатории российского партнёра по отработанным ранее методикам, которые, однако, будут оптимизированы для синтеза микроколичеств целевого вещества. Поскольку по химическим свойствам изопростан E2 и простагландин E2 близки, методика будет отработана на более доступном простагландине E2.
Дофаминамид простагдандина E2 является предполагаемым продуктом ферментативного окисления дофаминамида арахидоновой кислоты, тогда как в результате её окисления реактивными формами кислорода возможно образование дофаминамида изопростана E2. Оба соединения ранее не были обнаружены в живых организмах, возможно, из-за отсутствия стандартов этих веществ. Исследования данного проекта позволят решить эту проблему. Ранее в лаборатории российского партнера было показано, что присоединение остатка дофамина к другому природному соединению изменяет свойства последнего, в частности, усиливает нейрозащитные его свойства. Учитывая эти данные в проекте предполагается наряду с дофаминамидом простагландина E2, синтез которого будет масштабирован до загрузок в 100 мг исходного простагландина, синтезировать два аналога, у которых простагландин и дофамин будут разделены органическим соединением с двумя и четырьмя углеродными атомами. Для этого также будут подобраны оптимальные методики синтеза, а наработка этих веществ будет осуществлена в количестве не ниже 50 мг, что позволит использовать их в опытах на лабораторных животных. Структуры синтезированных соединений, подтверждённые с помощью ЯМР- и масс-спектрометрии, будут проанализированы математическими методами молекулярного моделирования. Сопоставление полученных данных с результатами биологических испытаний позволят сделать предварительные выводы о структурно-функциональных отношениях в ряду этих веществ. Биологически тесты планируется провести на двух типах моделей: клеточных культурах и лабораторных мышах и крысах. В виду крайне малого количества доступных изо- и нейропростанов, оценка их биологической активности будет проведена на культурах линейных клеток в опытах по индукции или ингибированию воспалительного ответа клеток макрофагов мыши RAW 264.7. В этих клетках под действием про-воспалительных агентов увеличивается продукция оксида азота, который определяют по методу Гриса, модифицированному в лаборатории российского партнёра. Активность дофаминамида простагландина E2 и его двух аналогов дополнительно будет оценена в тесте на нейропротекцию на культуре линейных клеток. а также на первичной культуре нейрональных клеток, полученной от новорожденных крысят. В дополнение к этим тестам запланирована оценка способности дофаминамида простагландина E2 ингибировать рост линейных клеточных культур раковых клеток на панели из 5 линий, согласно методике, которая успешно используется в лаборатории российского партнёра. В последних двух моделях в качестве вещества сравнения будет использован дофаминамид арахидоновой кислоты – предполагаемый биосинтетический предшественник дофаминамида простагландина E2.
Наиболее активное в тесте на нейропротекцию вещество будет испытано на модели ишемического повреждения головного мозга по способности вещества уменьшать зону некротического поражения. Для этого же соединения запланировано определение его влияния на системную гемодинамику и мозговой кровоток.
Третий блок задач относится к разработке аналитических процедур определения нейро- и изопростанов в биологических образцах. Анализ этого класса веществ пока не используется в качестве диагностического теста в отечественной клинической медицине из-за отсутствия методик и стандартов. Разработка таких методик позволит ликвидировать этот пробел и позволит в будущем внедрить эти тесты в практику. Важными этапами методики являются: сбор образцов, эффективная экстракция анализируемого вещества, пробоподготовка, анализ смеси с помощью хромато-масс-спектрометрии. Для количественного анализа нейропростанов будут использованы синтезированные французским партнёром соответствующие дейтерированные производные. В качестве биологического материала будут использованы клеточные культуры и гомогенаты тканей мозга крысы.
Все полученные количественные данные будут обобщены в базе данных, создаваемой на основе лицензионной коммерческой программы.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Результаты выполнения проекта могут быть использованы:
в качестве научного задела для проведения дальнейших исследований по поиску липидных биомаркеров социально-значимых заболеваний;
как основа для разработки нового типа лекарственных препаратов, сочетающих фрагменты молекул высокоактивных эндогенных биорегуляторов;
как прототип нового нейрозащитного агента;
как аналитические методики в организациях здравоохранения.
При условии оснащения лечебных и диагностических центров хромато-масс-спетрометрами разработанные методики определения уровня продуктов свободно-радикального окисления липидов по количеству изопростанов различных типов со временем могут заменить используемые в настоящее время неселективные тесты, часто дающие ложные результаты. На первом этапе внедрения эти методики будут доступны в ведущих областных диагностических центрах.
Проведённые исследования позволят расширить спектр липидных биомаркеров за счёт определения нового типа изопростанов – продуктов свободно-радикального окисления эндогенных ацилдофаминов, что имеет важное значение как для отечественного, здравоохранения, так и для организаций здравоохранения зарубежного партнера. Совместно разработанные синтетические методики позволят в дальнейшем наладить препаративный синтез этих стандартов для включения в наборы для анализа изопростанов. Предполагается, что наличие стандартов изопростанов позволит существенно продвинуть исследования по связи определённых видов патологий с уникальным набором изопростанов, что не только повысит точность диагноза, но и позволит выявлять ранние стадии развития заболевания до клинических проявлений.
Результаты исследований нейрозащитного действия и других биологических эффектов новых синтезированных веществ позволят оценить возможный потенциал нового класса производных природных простагландинов в качестве прототипов лекарственных препаратов для лечения нейродегенеративных патологий. В случае получения положительных результатов на стартовом наборе новых дофаминамидов простагландина E2 (синтезированных в данном проекте) могут быть созданы новые эффективные лекарственные препараты после проведения оптимизации структуры молекулы и дополнительных расширенных фармакологических испытаний.

Текущие результаты проекта:
В результате проведённых исследований :
1. Синтезированы дофаминамиды простагландина E2 (PGE2-DA) и15-epi-15-E2t-IsoP с использованием усовершенствованной синтетической методики. Также синтезированы аналоги PGE2-DA, в которых между карбоксильной группой простагландина и аминогруппой дофамина находится молекулярная вставка длиной два (PGE2-C2-DA) и четыре (PGE2-C4-DA) углеродных атома.
2. Показано, что в отличие от простагландина E2 его дофаминамид (PGE2-DA) обладает нейрозащитными свойствами в модели глутаматной токсичности на гранулярных нейронах мозжечка крысы и по активности сравним с N-арахидоноилдофамином (NADA).
3. В опытах на культуре макрофагов PGE2-DA, PGE2-C2-DA и PGE2-C4-DA проявляют выраженные противовоспалительные свойства, ингибируя индуцированную провоспалительными стимулами генерацию оксида азота с IC50 18±2, 27±2, 11±5 мкМ соответственно, что несколько слабее эффекта NADA (IC50 8±3 мкМ). В этой же тест-системе изопростан и нейропростаны были умеренно активны, ингибирующий эффект был в интервале 55–90% при 50 мкМ. Самым активным соединением оказался дофаминамид 15-эпи-15E2t-изопростана (75% ингибирования при 0.5 мкМ).
4. В экспериментах на культурах шести онкотрансформированных клеток различного происхождения PGE2-DA в отличие от NADA проявил себя более селективным и значительно менее активным цитотоксическим агентом, но как и NADA он был толерантен к пролиферирующим клеткам неракового происхождения.
5. В экспериментах на лабораторных мышах установлено, что дофаминамид простагландина E2, а также два его аналога обладают противовоспалительным действием в дозе 10 мг/кг при внутрибрюшинном введении. Но из всех трех испытанных соединений только дофаминамид простагландина E2 проявил статистически значимое антиноцицептивное действие.
6. Разработан новый метод анализа простаноидов и изопростанов в виде их дансилгидразидов с последующим анализом методом LC-MS. Разработаны протоколы определения содержания нейропростанов и дофаминамидов простагландина E2 и15-epi-15-E2t-IsoP в биологических образцах с использованием масс-спектрометрии высокого разрешения.
7. Создана база данных всех синтезированных соединений, включающих информацию о структурах, данные физико-химического анализа, биологических испытаний, а также результаты проведенного молекулярного моделирования структур всех целевых соединений и их молекулярные дескрипторы.
8. Проведенный патентный поиск показал патентоспособность синтезированных производных простагландина E2, содержащих дофамин, два их которых являются принципиально новыми соединениями, а у дофаминамида простагландина E2 выявлены ранее не описанные свойства.
9. В лаборатории зарубежного партнера разработаны лабораторные методики синтеза 10(RS)-10F4t- 4-F4.t- нейропростанов и их дейтерированных производных, а также 15-эпи-15E2t-изопростана