Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка регенерируемого электрохимического биосенсора на основе аптамер-активированных углеродных нанотрубок для детектирования маркеров вирусов гепатита B и C

Докладчик: Бобринецкий Иван Иванович

Должность: ведущий научный сотрудник, нет, д.т.н.

Цель проекта:
1. Создание экспериментального образца регенерируемого нанопроводного биосенсора для регистрации белковых маркеров социально-значимых заболеваний в фракциях крови. 2. Разработка и исследование технологических основ формирования электрохимических биологических сенсоров на основе углеродных нанотрубок, модифицированных специфичными аптамерами, для детектирования содержания вирусов в крови (в частности вируса гепатита), обеспечивающих переход к созданию новых видов быстродействующих и селективных диагностических систем.

Основные планируемые результаты проекта:
1. Исследование ковалентной иммобилизации углеродных нанотрубок аффинными реагентам на основе
специфичных аптамеров.
Предполагается проведение теоретических расчетов и моделирование композитных молекулярных
структур. В качестве основы будут выбраны углеродные нанотрубки, обладающие свойствами высокой
электропроводности, механической жесткости, и периодической (кристаллической) структурой. В качестве
моделей нанотрубок будет выбрано несколько базисов типов нанотрубок.
В работе будут рассмотрены двух- и трехкомпонентные системы. Второй и третьей компонентой будут
являться биологические полимеры - аптамеры (последовательности нуклеотидов) и белки соответственно.
Будут проведены расчеты микроскопических параметров формируемых коньюгатов. Для проведения
первичных аналитических расчетов для минимизации потенциального барьера, возникающего между
проводящей нанотрубкой и биополимером будет проведено моделирование транспорта заряда в системе из
углеродной нанотрубки, окруженной различными молекулами.
Моделирование геометрии и энергетических свойств контактов будет проведено полуэмпирическими
квантовомеханическими методами (PM6, AM1) и методами молекулярной динамики mm2, UFF, которые
позволяют рассчитывать большие кластеры (энергии уровней, молекулярных орбиталей и
межмолекулярных связей) за сравнительно небольшие затраты машинного времени с приемлемой
точностью
Определение влияния нанопроводников на структуру аптамера будет проводиться с использованием
крупномасштабного моделирования электронной структуры, в том числе, методами молекулярной
динамики, с привлечением суперкомпьютерных ресурсов НИВЦ МГУ. Впервые будут найдены решения
для построения моделей структуры и моделирования молекулярной динамики ковалентных коньюгатов
ДНК и нанотрубок.

2 Разработка лабораторного регламента изготовления экспериментальных образцов биосенсорного
устройства на основе углеродных нанотрубок со связанными аминомодифицированными аптамерами. Для
формирования биосенсоров в работе предлагается использовать методы традиционной микроэлектронной
литографии, а также методы локального позиционирования нанопроводников при взаимодействии с
внешним ориентирующим электрическим полем. Данный метод позволяет создать интегрированный на
одной пластине массив сенсорных чипов, что значительно повышает производственный выход, в отличие
от методов, основанных на использовании электронной или наноимпринт-литографии. В качестве
аптамеров предполагается использование стандартных аптамеров из существующих библиотек,
специфичных к NS белкам - маркеру для обнаружения гепатита С, и к P-белкам -для обнаружения
гепатита В. Также будут рассмотрены возможные варианты модификации аптамеров для повышения
селективности сенсоров. Аминная модификация аптамеров необходима для ковалентной сшивки аптамера
с карбоксильными группами на модифицированных нанотрубках, что позволит обеспечить
регенерируемость сенсора в процессе нескольких последовательных измерений. В частности, для маркера
вируса В может быть использована следующая последовательность 5`GCGGGTCGACGTTTG……N (25)
……CACATCCATGGGCGG –NH2 -´3, где N(25) - произвольная последовательность нуклеотидов.
Использование аптамеров, в отличие от использования антител, позволит разработать методы
приготовления заданных функциональных растворов углеродных нанотрубок, активированных
аптамерами, что создаст предпосылки для разработки производственной технологической линейки с
формированием чувствительного слоя методами полимерной электроники (струйной печати, например)
Для формирования функциональных слоев нанотрубка-аптамер будут разработаны два маршрута
формирования структуры с равномерными, тонкими пленками углеродных нанотрубок и структуры на
одиночных нанотрубках. В первом случае будет обеспечена высокая производительность метода
изготовления сенсорных структур, во втором –высокая чувствительность структур. Далее в работе
предполагается сравнить два данных метода с целью оптимизации параметров разрабатываемого
биосенсора. Для локализации и ориентирования сеток нанотрубок предполагается использование методики
диэлектрофореза. Для формирования пленки требуемой плотности будут подобраны параметры
осаждения: амплитуда переменного напряжения, частота, время осаждения.
Для формирования конечной структуры будет произведена разработка литографического маршрута.
Геометрия электродов будет выбрана с учетом оценок распределения линий поля при проведении
диэлектрофореза, обеспечивающая впоследствии получение равномерной сетки нанотрубок. В итоге, будет
предложен лабораторный регламент, обеспечивающий формирование интегральных регенерируемых
биологических сенсоров высокой селективности и чувствительности.

3. Изготовление экспериментальных образцов биосенсорного устройства на основе углеродных
нанотрубок, со связанными аминомодифицированными специфичными аптамерами для проведения
исследовательских испытаний. Впервые будут исследованы процессы электрокинетического осаждения
нанопроводников (нанотрубок) из растворов, содержащих органические материалы (линкеры, аптамеры) и
различающихся дипольным моментом. Варьирование электрических параметров как модифицированных
нанопроводников, так и раствора, их содержащих, позволит выявить новые закономерности в поведении
нанопроводников в слабых электрических полях при формировании интегрированных биосенсоров. Будут
исследованы различные подходы для пассивации слоев металлизации диэлектриками, обладающими как
высокими изоляционными свойствами, так и высокой биологической совместимостью, что позволит
обеспечить низкие токи утечек нанопроводного транзистора с возможностью in situ контроля параметров
биологического раствора.
Будут разработаны методики связывания нанотрубки с молекулами, в качестве которых будут выбраны
короткие основания одиночной цепочки ДНК - аптамеры, что может быть сделано двумя принципиально
разными способами – с помощью гидрофобного либо ковалентного взаимодействия. Для предотвращения
неспецифичных связываний сами нанотрубки должны быть покрыты изолирующим материалом, например
этаноламином, Tween, или другим неионогенным поверхностно-активным веществом.
Для материала гибкой подложки будет дополнительно проведено моделирование взаимодействия
функционализированных углеродных нанотрубок с полиэтиленнафталаотом с учетом различия
коэффициентов температурного расширения , а также механических напряжений, возникающих в данных
системах.
Будет разработана конструктивная модель устройства жидкостной ячейки для формирования сенсорного
чипа, работающего в жидкостных средах, в том числе в крови. Впервые будет предложена конструкция
сенсорного чипа элеткрохимического действия, состоящего полностью из биосовместимых материалов
(положка, сенсорный слой, изоляционное покрытие), обеспечивающее перспективное применение
сенсоров in vivo, и значительно снижающие паразитные эффекты при измерениях in vitro.

4. Разработка программы и методики исследовательских испытаний экспериментальных образцов
биосенсорного устройства на основе углеродных нанотрубок, со связанными аминомодифицированными
специфичными аптамерами для определения чувствительности и селективности к различным видам и
концентрациям белков – маркеров гепатита.
Будет предложена комплексная методика сравнительного анализа чувствительности разработанных
датчиков на основе контрольных и рабочих экспериментов. Контрольные эксперименты предполагается
проводить на основе изучения изменений цитокинового профиля в пробах, содержащих различные
вирусные препараты (Гепатита С и В).
Работоспособность и предельная чувствительность разработанных датчиков будет оцениваться по
искусственно приготовленным пробам NS белков (маркера для обнаружения гепатита С), и P-белков (для
обнаружения гепатита В) в буферных растворах с заранее заданной концентрацией вплоть до фемтомоль.
Будут исследованы изменения коньюгатов нанотрубка-аптамер в присутствии белкового маркера гепатита
методами спектроскопии комбинационного рассеяния, рентгеновской дифракции, атомно-силовой
микроскопии и электронной микроскопии для выявления структурных, химических и физических
изменений в процессе детектирования, что позволит повысить чувствительность, быстродействие и
селективность разрабатываемого биосенсорного устройства.
Таким образом будет предложена новая методика испытаний, основанная на комплиментарном анализе
отклика разработанных сенсора с дополнительными методами контроля прохождения реакции на
поверхности нанопроводных структур.

5 Исследование экспериментальных образцов биосенсорного устройства на основе углеродных
нанотрубок, со связанными аминомодифицированными специфичными аптамерами. Будут проведены
исследования, направленные на определение селективности разработанного биосенсора к белкам –
маркерам гепатита в сравнении с фоновым белком (альбумином). Будут проведены исследования для
выявления чувствительности к минимальным концентрациям белков-маркеров гепатита (вплоть до
фемтомоль) в пробах как специально подготовленных в буферном растворе, так и биологического
происхождении для проведения испытания in vitro при детектировании содержания белков-маркеров
гепатита в пробах крови. Будет проведена оценка скорости отклика биосенсора при различных входных
условиях: различная концентрация белка, температура пробы, динамики исследуемой жидкости. Должно
быть получено предельное временное разрешение до 60 секунд. Также впервые будут проведены in vitro
испытания биологического сенсора при приложенных механических воздействиях (сгибание/разгибание
подложки), что позволит определить возможность использования сенсорного устройства in vivo.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Учитывая высокий научно-технических уровень предлагаемой разработки (по сути, предполагается в
первые вывести на рынок биологический сенсор на основе углеродных нанотрубок) и высокий потенциал
технологической реализации (предлагаемая к разработке технология как формирования чувствительного
нанопроводного слоя, как и его иммобилизация аффинными реагентами (аптамерами) не потребует
высоких затрат на переоборудование традиционных площадок производства гибких интегральных
компонентов), возможно широкое межотраслевое применение результатов:
- Разработка технологической линейки производства биологических сенсоров для экспресс-тестов на
гепатит. Производство может быть организовано как «с нуля», таки и в виде переоснащения стандартного
завода по производству пластиковых электронных карт: например, может быть переоборудован цех по
производству транспортных карт на заводе ОАО «НИИМЭ» и завод МИКРОН», Зеленоград.
- Разработка технологической линейки для создания универсальной тестовой платформы для верификации
и контроля процесса синтеза специфичных аптамеров. Данное направление закрывает широкую область
задач, связанную с необходимостью точного контроля специфичности аптамеров при разработке новых
последовательностей для изготовлении лекарственных препаратов нового поколения. Метод
электрохимического скрининга может явиться достаточно надежной, простой в использовании и дешевой
технологией контроля качества синтезированных новых последовательностей аптамеров, например, по
методу SELEX.
Прогнозная характеристика конкурентных преимуществ результатов работы и оценка ожидаемого народно-
хозяйственного эффекта их использования
Основным результатом работы является разработка высокочувствительного, быстродействующего
компактного сенсорного устройства, обеспечивающего определения содержания вируса гепатита в крови.
При проведении соответствующей информационной работы с категориями, входящими в группу риска по
данному заболеванию, направленного на проведение стимулирование интереса к оперативному анализу
крови, может быть существенно уменьшен фактор заболеваемости по данной вирусной группе. В 2011 году
Министерство здравоохранения и социальных служб США опубликовало План действий по
предотвращению, осведомленности и лечению вирусного гепатита (COMBATING THE SILENT
EPIDEMIC of VIRAL HEPATITIS - Action Plan for the Prevention, Care & Treatment of Viral Hepatitis),
согласно которому первое место в решении данной проблемы отводится совершению методов анализа и
обнаружение вирусного гепатита. В совокупности с другими факторами, данный плен к 2020 году должен
привести к следующим показателям:
- увеличение числа осведомленных людей об их заражении вирусом гепатита B с 33% до 66%;
- увеличение числа осведомленных людей об их заражении вирусом гепатита C с 45% до 66%;
- уменьшение на 25% числа новых заражений гепатитом С;
- полная ликвидация случаев передачи вируса гепатита B от «матери к ребенку».
Несомненно, разработка одного сенсора, обладающего всеми возможными лучшими свойствами, не может
решить проблему, которое носит для Росси системный характер, но при соответствующей руководящей
воле, применение результатов работ позволит значительно повысить соотношение первых трех параметров
в виду изначального низкого старта по эпидемиологической обстановке в Российской Федерации.
Обоснование перспективности вновь создаваемой интеллектуальной собственности
По сути, в проекте предполагается создание принципиально новой продукции – высокочувствительных
портативных датчиков содержания маркеров социально-значимых заболеваний, обладающего высокой
чувствительностью и быстродействием, и потенциально обеспечивающего применение in vivo. В проекте
заложено несколько технических способных к патентованию решений:
- способ сборки сенсорного слоя за счет комбинации методов полимерной печати и биохимического
синтеза;
- способ детектирования маркеров вирусных заболеваний в крови за счет одновременного измерения
изменения проводимости системы и сдвига порогового напряжения сформированного нанопроводной
системой транзистора в системе интегрированного электрода сравнения, выполненного в форме
нанопровода;
- конструкция сенсорного устройства, состоящего полностью из биосовместимых материалов на гибкой
основе.
Прогнозная оценка производственных условий и факторов:
Благодаря возможности комбинирования традиционных методов формирования нанопроволочных
структур на относительно больших областях методами полимерной печати, и отработанным в России
методов SELEX для синтеза аптамеров с заданными последовательностями нуклеотидов после завершения
Проекта возможен быстрый переход к ОКР по разработке опытной промышленной линейки изготовления
сенсоров. Оценка необходимого капиталовложения со стороны государства составляет порядка 150 млн.
рублей, что соответствует суммам финансового обеспечения, выделяемого Министерством
промышленности и торговли по соответствующим направлениям. При этом производство сенсорного слоя,
его корпусирование и разводку целесообразно делать на одном предприятии, а также блока анализа и
обработки информации. Производство и поставку аптамера целесообразно отдать на аутсортинг для
минимизации рисков и производственных издержек.

Текущие результаты проекта:
1) Выполнен аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей научно-техническую проблему, исследу-емую в рамках НИР. Выполнен выбор и обоснование направления исследований в области создания сенсора гепатита на основе аптамер-модифицированных углерод-ных нанотрубок.
2) Проведен анализ более 50 источников и определена высокая перспектив-ность предложенного способа решения проблемы.
3) Предлагаемые методики являются новыми в области предложения одно-временного использования углеродных материалов, ковалентно-связанных с угле-родными нанотрубками, а также методов их иммобилизации на поверхности гибких подложек.
4) Полученные результаты полностью удовлетворяют требованиям к выпол-няемому проекту.
4) Полученные результаты находятся на мировом уровне, а в ряде методики превышают его.