Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка опто- и хемогенетических методов регистрации и коррекции нарушения нейрогенеза

Докладчик: Касымов Виталий Анварович

Должность: Заведующий лабораторией

Цель проекта:
Создание методик на основе функциональных и/или генетически кодируемых сенсоров для выявления нарушений нейрогенеза взрослого мозга, разработка средств его восстановления и стимуляции.

Основные планируемые результаты проекта:
В рамках данного проекта будет изготовлена системы моделирования нейрогенеза и решены следующие задачи:
1) Создание генетических конструкции для экспрессии DREADDs в клетках. Для создания конструкций будут использованы ленти- и/или аденоассоциированные вирусные векторы, в которые с использованием технологии клонирования Golden Gate будет внедрен GFAP-промотор, обуславливающий селективную экспрессию в астроцитах. В экспрессионную кассету будет также входить GFP в качестве маркерного гена. Будет создано несколько генетических конструкций, включающие rM3Dq, rM3Di, rM3Ds –рецепторы (согласно принятой номенклатуре. R-крысиный; M3D – мускариновый рецептор 3 типа; q,i,s – типы активируемых G-белков).
2) Определение изменений в специфических сигнальных путях, в модифицированных с использованием технологии DREADDs клетках in vitro. Данная задача направлена на определение клеточных сигнальных путей, активируемых и/или ингибируемых при аппликации CNO в клетках in vitro. Для решения этой задачи, клетки мозга (нейроны и астроциты), полученные от 5-дневных крысят будут культивированы в среде DMEM в течение 3-х дней. По истечение этого срока клетки будут трансфецированны ранее полученной генетической конструкцией на основе аденоассоциированного вируса. Через 7 суток после трансфекции, с использованием лазерного сканирующего конфокального микроскопа, будет производиться ингибиторный анализ в трансфецированных и нетрансфецированных клетках. Будет произведено сравнение основных клеточных сигнальных путей (пуринергический каскад, WNT-каскад), выявлены изменения в механизмах и регуляции везикулярного транспорта (количественное определение глиотрансмиттеров во внеклеточной среде с применением LС MS/MS), определены изменения экспрессии белков везикулярного транспорта. Сравнения будет производиться между различными популяциями астроцитов гипоталамуса, кортекса, ствола мозга и гиппокампа, а также между модифицированными и немодифицированными астроцитами. Полученные функциональные данные будут подтверждены молекулярно-биологическими методами. В частности, будут определены уровни экспрессии мембранных транспортёров ионов, ключевых ферментов сигнальных каскадов, транскрипционных факторов (аденилатциклаза, NRF-1, NF-kb и др.) и белков везикулярного транспорта. Оценка уровня экспрессии будет проводиться с использованием метода ПЦР в реальном времени, с гидролизуемыми нуклеотидными зондами.
3) Ингибиторный анализ клеточных сигнальных путей с целью выявления изменений в метаболических и сигнальных путях клеток головного мозга. Регистрация ингибирования компонентов сигнальных и метаболических путей будет производиться с использованием метода конфокальной лазерной сканирующей микроскопии с флуоресцентной детекцией.
4) Исследование экспрессионного профиля астроцитов. Для точной количественной оценки экспрессии важнейших регуляторных генов астроцитов, среди которых гены, кодирующие аденилатциклазы, протеинкиназы, каспазы, а также транскрипционные факторы, будут использованы методы цифровой капельной ПЦР и секвенирования следующего поколения, позволяющие с наибольшей точность определить абсолютное количество копий мРНК соответствующих генов.
5) Количественная оценка везикулярного транспорта. С использованием технологии TIRF микроскопии культивированные астроциты будут нагружены инстравезикулярным флуоресцентным красителем - хинакрином. Активация пуринергического каскада приводит к высвобождению везикул, при котором будет производиться оценка количества событий слияния везикул с мембраной.
6) Количественная оценка изменений профиля глиотрансмиттеров. Данное исследование будет проводиться как in vitro, так и in vivo. В первом случае, с использованием методом масс-спектрометрии будет произведена количественная оценка глиотрансмиттеров (глутамат, молочная кислота, ГАМК, АТФ) в среде для культивировании при активации пуринергических и адренергических сигнальных каскадов, а также при индукции специфическим гормоном «насыщения» - грилином. В условиях in vivo количественный анализ глиотрансмиттеров будет проводиться в межклеточной жидкости, которая будет получена при фракционировании области гипоталамуса.
7) Проведение исследований по изучению регуляции выброса катехоламина нейронами и астроцитами, разработка методов и исследование эффектов ингибирования и активирования катехоламинергических нейронов посредством контроля астроцитарного выброса глиотрансмиттеров с использованием DREADDs. Для этого животные будут стереотаксически нагружены тремя типами DREADDs. При этом, внедрение различных типов DREADDs будет производиться в различные группы модельных животных. Через 7 – 14 дней после внедрения, DREADDs будут подвергаться активации CNO. Будут применены различные протоколы активации DREADDs. Планируется, что активации будет производиться 1 раз в 2 недели, а также каждые 48 часов в течение 2-х месяцев. В течение этого времени будут регистрироваться изменения клинической картины, скорости прогрессии заболевания у животных моделей. Каждые две недели, для части каждой группы животных будет производиться анализ количества основных нейротрансмиттеров, регулирующих выброс катехоламина. Кроме того, будет производиться количественная оценка катехоламина в межклеточном пространстве. Для количественной оценки нейротрансмиттеров будет использован метод масс-спектрометрии.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Результаты, полученные в ходе реализации данного, проекта могут быть использованы как в фундаментальных нейрофизиологических исследованиях (выявление клеточных и молекулярных основ нейропатологических состояний, механизмы взаимодействия различных популяций клеток мозга, детекция передача сигнала в норме и патологии), так и для низкоинвазивных методов коррекции нейропатологических состояний на модельных животных с последующим возможным применением в клинике. Полученные результаты будут способствовать развитию соответствующих направлений технологической платформы «Медицина будущего»: клеточной биологии, синтетической биологии, новых систем для терапии на основе молекулярных и клеточных мишеней.

Текущие результаты проекта:
Обоснован выбор направления исследований и проведен анализ научно-технической, нормативной и методической литературы.
Разработаны экспериментальные образцы генетических конструкций на основе вирусных векторов для трансфекции нейронов и астроцитов.
Разработан лабораторный протокол для создания генетических конструкций на основе вирусных векторов.
Разработан лабораторный протокол для создания первичных клеточных культур нейронов и астроцитов головного мозга крысы.
Проведена оценка уровня экспрессии мембранных ионных транспортеров и белков связанных с везикулярным транспортом.
Проведены патентные исследования в соответствии с ГОСТ Р 15.011-96