Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка подходов к оценке вариабельности митохондриального генома как маркера предрасположенности к сердечно-сосудистым и метаболическим заболеваниям

Докладчик: Сазонова Маргарита Александровна

Должность: старший научный сотрудник

Цель проекта:
Основной задачей, на решение которой направлен реализуемый проект, является разработка подходов к оценке вариабельности митохондриального генома как маркера предрасположенности к сердечно-сосудистым и метаболическим заболеваниям. Целью проекта является определение общих и популяционно-специфических вариантов митохондриального генома как генетических факторов сердечно-сосудистого риска, определяющих индивидуальную предрасположенность к атеросклерозу и связанным с ним заболеваниям в финской и российской популяциях, а также разработка ключевых подходов к оценке вариабельности митохондриального генома как маркера предрасположенности к сердечно-сосудистым и метаболическим заболеваниям. Для достижения поставленной цели будет проведен всесторонний анализ данных, полученных путем секвенирования митохондриального генома в репрезентативных выборках из Финляндии и России, включающих здоровых лиц, больных атеросклерозом, больных сахарным диабетом с использованием современных подходов биостатистики и биоинформатики. Поставленная цель позволит открыть новое поле поиска биомаркеров сердечно-сосудистого риска и разработать новые методы диагностики атеросклеротических и связанных с ним заболеваний. Прикладной задачей исследования является разработка универсального подхода к оценке и интерпретации вариантов митохондриального генома как маркера предрасположенности к сердечно-сосудистым и метаболическим заболеваниям. Проект будет реализован в сравнительном дизайне в двух репрезентативных выборках из параллельных исследований, проводимых в России и Финляндии. Для достижения цели проекта участники исследования, сопоставимые по возрасту и полу, будут набраны в Москве и в Хельсинки. Группа участников исследования, набранная в Хельсинки, будет включать практически здоровых лиц, не страдающих диабетом и атеросклерозом, и больных сахарным диабетом 2 типа. Группа участников исследования, набранная в Москве, будет включать в себя практически здоровых лиц, не страдающих диабетом и атеросклерозом, и больных атеросклерозом. Обе группы пройдут единообразное обследование, которое будет включать биохимическую и клиническую характеристику для выявления традиционных сердечно-сосудистых факторов риска. Число участников исследования будет превышать 80 для каждой группы. Будет проведено полногеномное секвенирование митохондриального генома с использованием секвенирования следующего поколения, чтобы выявить общие и популяционно-специфические варианты митохондриального генома, как генетические факторы сердечно-сосудистого риска. Комплексный анализ данных будет использовать современные подходы биостатистики и биоинформатики. В результате будут идентифицированы общие и специфические генетические факторы сердечно-сосудистого риска, которые определяют индивидуальную предрасположенность к атеросклерозу и диабету в выборках из финской и российской популяций. Будет разработана методика оценки межпопуляционной вариабельности генетических факторов сердечно-сосудистого риска.

Основные планируемые результаты проекта:
Основными планируемыми результатами проекта будут:
обзор и анализ современной научно-технической, нормативной, методической литературы по теме исследования; результаты сравнительной оценки вариантов решения научной проблемы и обоснование выбора оптимального варианта направления исследований; изложение методик проведения исследований; результаты экспериментальных исследований (в том числе: результаты скрининга и включения участников исследования; результаты оценки фенотипических сердечно-сосудистых факторов риска; результаты полногеномного секвенирования митохондриального генома; результаты биостатистического и биоинформационного анализа вариантов митохондриального генома);
описание новых эффективных методов скрининга, диагностики, мониторинга и лечения сердечно–сосудистых заболеваний; технико-экономическая оценка результатов научных исследований; обобщение и выводы по результатам научных исследований; предложения и рекомендации по реализации (коммерциализации) результатов научных исследований.Будет написана заявка на получение охранного документа (патента). Будут созданы: перечень выявленных вариантов митохондриального генома - маркеров предрасположенности к сердечно-сосудистым и метаболическим заболеваниям; методика оценки вариабельности митохондриального генома как маркера предрасположенности к сердечно-сосудистым и метаболическим заболеваниям; коллекция образцов ДНК, полученная от участников исследования из российской и финской популяций (в количестве не менее 160 образцов); файл данных с описанием клинико-лабораторных характеристик участников исследования и специфических генетических факторов риска заболеваний сердечно–сосудистой системы и метаболических нарушений.

Данный проект направлен на создание новых эффективных методов для скрининга, диагностики,
мониторинга и лечения основных сердечно-сосудистых заболеваний, и, следовательно, предоставит новые
и более эффективные средства по борьбе с эпидемией сердечно-сосудистых заболеваний, сахарного
диабета 2 типа и ожирением в России. Проект позволит разработать универсальный метод оценки и
интерпретации вариантов митохондриального генома в качестве маркера предрасположенности к сердечно-
сосудистым и метаболическим заболеваниям.

Основными характеристиками планируемых результатов будут следующие: разработанная в результате выполнения ПНИ методика оценки вариабельности митохондриального генома, которая будет использоваться для оценки предрасположенности к сердечно-сосудистым и метаболическим заболеваниям; разработанная в результате выполнения ПНИ методика оценки вариабельности митохондриального генома будет содержать перечень вариантов митохондриального генома - маркеров предрасположенности к сердечно-сосудистым и метаболическим заболеваниям для последующей разработки фокусированных диагностических наборов; определяемые варианты митохондриального генома - маркеры предрасположенности к сердечно-сосудистым и метаболическим заболеваниям будут принадлежать кодирующим областям митохондриального генома; определяемые варианты митохондриального генома - маркеры предрасположенности к сердечно-сосудистым и метаболическим заболеваниям будут определяться несинонимичными мутациями митохондриального генома; скрининг участников исследования будет проведен у здоровых лиц, больных атеросклерозом и больных сахарным диабетом 2 типа; маркеры предрасположенности к сердечно-сосудистым и метаболическим заболеваниям будут являться единичными нуклеотидными заменами, инсерциями или делециями митохондриальной ДНК; оценка фенотипа будет включать характеристику по следующим факторам риска атеросклероза: пол, возраст, индекс массы тела, артериальное давление, курение, полный липидный профиль сыворотки крови (общий холестерин, холестерин липопротеидов низкой плотности, холестерин липопротеидов высокой плотности, триглицериды, липидный индекс атерогенности), а также характеристику по расчетному риску ишемической болезни сердца по Фрамингемскому алгоритму с точностью оценки до 1 процента и по расчетному риску инфаркта миокарда по Мюнстерскому алгоритму с точностью оценки до 1 процента; банк образцов ДНК будет состоять из 80 образцов из российской популяции и 80 образцов лиц из финской популяции; концентрация ДНК в образцах будет составлять не менее 15 нг/мкл, значения соотношения А260/280 будут в пределах 1,8-2,0; в качестве материала для секвенирования будет использована обогащенная цельная митохондриальная ДНК человека или несколько ее фрагментов, полностью покрывающих цельную последовательность; количество ДНК, используемой для секвенирования, будет составлять 500 нг для каждого образца; оценка вариабельности митохондриального генома будет проводиться методом полногеномного секвенирования следующего поколения с не менее, чем 6-кратным прочтением последовательности митохондриальной ДНК; выявление вариантов митохондриального генома будет проведено с использованием специфического биоинформатического программного обеспечения, которое позволяет получать данные о наличии вариантов митохондриального генома в образцах на основе данных секвенирования, а именно: производить сборку генома, картирование прочтений на стандартную сравнительную последовательность митохондриальной ДНК, генерировать данные о количестве прочтений каждого нуклеотида в последовательности ДНК; будет использовано следующее программное обеспечение: GS DeNovo Assembler, GS Reference Mapper (Roche Diagnostics GMBH), Burrows-Wheeler Aligner, MitoTool; качество прочтения каждого отдельного нуклеотида в результате секвенирования будет соответствовать не менее чем 95%-ной вероятности безошибочной детекции; определение гаплотипов и гаплогрупп митохондриальной ДНК будет проведено на основании данных о всех однонуклеотидных заменах, отличающихся от стандартной сравнительной последовательности, с помощью программного обеспечения MitoTool (http://www.mitotool.org/) или подобного ему. Разработка должна вестись с учетом технически и экономически обоснованной унификации, стандартизации и взаимозаменяемости используемых компонентов. Для единообразия в формировании выборок, обследовании пациентов, качеству реактивов и характеристикам используемого оборудования, проведении лабораторных исследований, точности измерений, других технологических операций, оформлении документации, метрологических и общетехнических норм должно быть обеспечено в соответствии с ГОСТ Р 52379-2005 и ГОСТ Р 53434-2009. В целях оформления патентных заявок, на первом этапе выполнения научных исследований должны быть проведены патентные исследованияв соответствии ГОСТ Р 15.011-96; на остальных этапах ПНИ при получении результатов интеллектуальной деятельности (далее – РИД),способных к правовой охране (в соответствии со ст. 1225 ГК РФ), должны быть проведены дополнительные патентные исследования в соответствии с ГОСТ Р 15.011-96; должны быть представлены сведения об охранных и иных документах, которые будут препятствовать применению результатов работ в Российской Федерации (и в других странах – по требованию заказчика), и условия их использования с представлением соответствующих обоснованных предложений и расчетов; при получении результатов интеллектуальной деятельности, способных к правовой охране, они должны быть зарегистрированы в соответствии с законодательством РФ; обладающая коммерческим потенциалом совместная интеллектуальная собственность, полученная в ходе работ, должна быть защищена в соответствии с российским и международным законодательством.

Считается, что сердечно-сосудистые и связанные с ними заболевания ассоциированы с биологическим старением клеток и повреждением
митохондриального генома, которое, в свою очередь, является одним из показателей и механических
факторов старения. В то же время, ассоциация вариабельности митохондриальной ДНК с возрастными
дегенеративными заболеваниями и метаболическими нарушениями остается неизвестной.
Митохондриальный геном менее хорошо изучен , несмотря на свой небольшой размер. Новизна данного проекта состоит в том, что он направлен на оценку роли вариантов митохондриальной ДНК в сердечно-сосудистых заболеваниях и связанных с ними болезней обмена
веществ человека.
Согласно литературным данным, за последнее десятилетие, в условиях стремительного расширения возможностей молекулярно-генетического анализа, большое количество публикаций в области медицинской генетики было посвящено поиску генетических биомаркеров сердечно-сосудистых заболеваний в ядерном геноме человека. Ассоциация с атеросклерозом и ИБС была обнаружена для полиморфизмов в генах, продукты которых так или иначе вовлечены в метаболизм сосудистой стенки. На развитие и прогрессирование ИБС могут повлиять генетически обусловленные вариации активности белков, вовлеченных в патогенез атеросклероза и его осложнений, в том числе участвующие в процессах активации эндотелия, развитии воспалительных реакций, регуляции миграции и пролиферации гладкомышечных клеток, а также связанные с коагуляцией и фибринолизом . Но даже в сравнении с отдельными традиционными факторами риска сердечно-сосудистых заболеваний, мутации ядерного генома, как факторы риска, имеют весьма низкую диагностическую и прогностическую значимость. При наличии любого из вариантов полиморфизмов, достоверно ассоциированного с какими-либо сердечно-сосудистыми заболеваниями, относительный риск варьирует в пределах 1,06-1,40. В совокупности, все известные полиморфизмы ядерного генома объясняют не более 5% наличия сердечно-сосудистых заболеваний. Поиск мутаций митохондриального генома, ассоциированных с атеросклерозом и ИБС, может привести к их включению в список генетических факторов риска и увеличить экспланаторную ценность совокупности генетических маркеров сердечно-сосудистых заболеваний.
Ключевые ссылки:
[1] Taylor RW, Turnbull DM. Mitochondrial DNA mutations in human disease. Nat Rev Genet. 2005 6:389-402.
[2] Li M, Schonberg A, Schaefer M, Schroeder R, Nasidze I, Stoneking M. Detecting heteroplasmy from high-
throughput sequencing of complete human mitochondrial DNA genomes. Am J Hum Genet. 2010 87:237-249.
[3] Elliott HR, Samuels DC, Eden JA, Relton CL, Chinnery PF. Pathogenic mitochondrial DNA mutations are
common in the general population. Am J Hum Genet. 2008 83:254-260.
[4] Wallace DC. Mitochondrial DNA mutations in disease and aging. Environ Mol Mutagen. 2010 51:440-450.
[5] Schon EA, Bonilla E, DiMauro S. Mitochondrial DNA mutations and pathogenesis. J Bioenerget Biomembr.
1997 29:131-149.
[6] Lane D.A., Grant P.J. Role of hemostatic gene polymorphisms in venous and arterial thrombotic disease.
Blood. – 2000. –Vol.95, №5. – P.1517-32.
[7] Damani S.B.,Topol E.J. Future use of genomics in coronary artery disease. J Am Coll Cardiol. – 2007. – Vol.50, №20. – P.1933-40.
[8] Packard R.R.,Libby P. Inflammation in atherosclerosis: from vascular biology to biomarker discovery and risk prediction. Clin Chem. – 2008. – Vol.54, №1. – P. 24-38.
[9] John P.A., Ioannidis M.D. Prediction of Cardiovascular Disease Outcomes and Established Cardiovascular Risk Factors by Genome-Wide Association Markers // Circ. Cardiovasc. Genet. - 2009, - Vol.2, №1. - P. 7-15.
[10] Park CB, Larsson NG. Mitochondrial DNA mutations in disease and aging. J Cell Biol. 2011 193:809-818.
[11] Sobenin IA, Sazonova MA, Postnov AY, Bobryshev YV, Orekhov AN. Changes of mitochondria in
atherosclerosis: Possible determinant in the pathogenesis of the disease. Atherosclerosis. 2013 227(2):283-288.
[12] Mercer JR, Cheng KK, Figg N, Gorenne I, Mahmoudi M, Griffin J, et al. DNA damage links mitochondrial
dysfunction to atherosclerosis and the metabolic syndrome. Circ Res. 2011 107:1021-1031.
[13] Nomiyama T, Tanaka Y, Piao L, Hattori N, Uchino H, Watada H, et al. Accumulation of somatic mutation in
mitochondrial DNA and atherosclerosis in diabetic patients. Ann N Y Acad Sci. 2004 1011:193-204.
[14] Sobenin IA, Sazonova MA, Postnov AY, Salonen JT, Bobryshev YV, Orekhov AN. Association of
mitochondrial genetic variation with carotid atherosclerosis. PLoS One. 2013 8:e68070.
[15] Sobenin IA, Chistiakov DA, Bobryshev YV, Postnov AY, Orekhov AN. Mitochondrial mutations in
atherosclerosis:new solutions in research and possible clinical applications. Curr Pharm Des. 2013 19:5942–5953.

Для достижения заявленных результатов будет необходимо: проанализировать научно-техническую литературу, нормативно-техническую документацию и другие материалы, связанные с темой разработки; обосновать разработку методики оценки вариабельности митохондриального генома как маркера предрасположенности к сердечно-сосудистым и метаболическим заболеваниям;
выполнить сравнительную оценку вариантов решений проблемы и выбор методов, средств, направлений исследований и способов решения поставленных задач;разработать программу экспериментальных исследований с учетом требований ГОСТ Р 53434-2009; разработать типовые формы документирования экспериментов; разработать порядок выполнения типовых операций подготовки, выполнения и обработки результатов экспериментов; на основании проведения скрининга создать выборку участников исследования из российской популяции в количестве 80 человек, включающая здоровых лиц без клинических признаков атеросклероза и больных атеросклерозом; Участники исследования должны быть охарактеризованы по следующим факторам риска атеросклероза: пол, возраст, индекс массы тела, артериальное давление, курение, полный липидный профиль сыворотки крови (общий холестерин, холестерин липопротеидов низкой плотности, холестерин липопротеидов высокой плотности, триглицериды, липидный индекс атерогенности); охарактеризовать участников исследования по расчетному риску ишемической болезни сердца по Фрамингемскому алгоритму с точностью оценки до 1 процента и по расчетному риску инфаркта миокарда по Мюнстерскому алгоритму с точностью оценки до 1 процента; создать банк образцов ДНК из крови 80 участников исследования; провести полногеномное секвенирование митохондриальной ДНК из крови 80 участников исследования, включая как здоровых лиц без клинических признаков атеросклероза, так и больных атеросклерозом, с использованием технологии секвенирования следующего поколения; провести биостатистический и биоинформационный анализ вариантов митохондриального генома у 80 участников исследования из российской популяции, который должен включать в себя: сборку митохондриального генома и картирование на стандартную сравнительную последовательность; определение достоверности выявления мутаций митохондриального генома на основании анализа качества данных секвенирования; выявление статистически значимых различий во встречаемости вариантов митохондриального генома у здоровых лиц без клинических признаков атеросклероза и больных атеросклерозом; на основании результатов полногеномного секвенирования митохондриальной ДНК выявить варианты митохондриального генома, определяющие индивидуальную предрасположенность к атеросклерозу и связанным с ним заболеваниям; по результатам исследования разработать перечень вариантов митохондриального генома - маркеров предрасположенности к сердечно-сосудистым и метаболическим заболеваниям в количестве не менее 20 вариантов; по результатам исследования разработать методика оценки вариабельности митохондриального генома как маркера предрасположенности к сердечно-сосудистым и метаболическим заболеваниям.В соответствии с Соглашением о сотрудничестве от 15.09.2014 между Федеральным государственным бюджетным учреждением «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Министерства здравоохранения Российской Федерации (г. Москва, Российская Федерация) и Институтом Хьелта Университета Хельсинки (Хельсинки, Финляндия) иностранный партнер должен: скринировать здоровых лиц и больных сахарным диабетом из финской популяции; включить 80 участников исследования из финской популяции; оценить фенотипические сердечно-сосудистые факторы риска у 80 участников исследования из финской популяции; создать банк образцов ДНК от 80 участников исследования из финского финской популяции; секвенировать полный митохондриальный геном у 80 участников исследования из финской популяции; провести биостатистический и биоинформационный анализ вариантов митохондриального генома у 80 участников исследования из финской популяции. Статистическую обработку результатов исследований провести с использованием программного пакета SPSS версии 16.0 и выше; сопоставить анализ научно-информационных источников и результатов выполненной разработки; разработать и подать заявку на охранный документ (патент).

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Областями применения полученных результатов или создаваемой на их основе инновационной
продукции являются медицина, здравоохранение, профилактические программы. Результаты ПНИ могут быть
использованы научно-исследовательскими учреждениями в сотрудничестве с производственными
компаниями для проведения ОКР/ОТР, направленных на создание методик и аппаратно-программных
комплексов для диагностики, профилактики и лечения сердечно- сосудистых заболеваний, разработки
геномных и постгеномных лекарственных средств для лечения сердечно-сосудистых заболеваний
в сотрудничестве с производственными компаниями, создания технологии лечения атеросклеротических
заболеваний. Диагностика индивидуальной предрасположенности к атеросклерозу и сахарному диабету,
путем выявления патологических вариантов митохондриального генома – генетических маркеров
атеросклероза, будет способствовать более качественному определению индивидуального риска развития
сердечно-сосудистых и связанных с ними заболеваний и осложнений, и последующей
разработке персонализированной стратегии профилактики.
Возможными потребителями планируемых результатов могут быть ООО "ИНАТ-Фарма", ООО "Медицинские инновации",
ООО "Праймбиомед", ЗАО «ФАРМ-СИНТЕЗ», ЗАО "Ин-Витро", ЗАО "OnClinic".
Российская и финская стороны, участвующие в проекте, являются признанными мировыми лидерами в исследованиях по
взаимодействию традиционных, экологических и генетических факторов риска сердечно-сосудистых
заболеваний, и прогрессирования/регрессии атеросклероза. Финский член команды проекта является
признанным экспертом в исследованиях атерогенных нарушений липидного обмена. Российский участник
проекта является признанным экспертом в исследованиях клеточных и молекулярных механизмов
атеросклероза и поиске новых генетических факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний.
Совокупный опыт обеих сторон позволит успешно решить задачи предлагаемого проекта и будет способствовать дальнейшему развитию исследований в рамках международного сотрудничества.
В целях демонстрации и популяризации результатов проекта планируются: опубликовать полученные результаты в ведущих научных журналах, индексируемых в базе данных Scopus или в базе данных "Сеть науки" (WEB of Science); сравненить проводимые исследования с лучшими аналогичными исследованиями и соотнести их с полученными результатами; привлечь международных и российских экспертов к оценке результатов выполненных работ; сделать доклады и обсудить полученные результаты на международных научных конференциях (European Atherosclerosis Society, International Atherosclerosis Society, American Heart Association, American College of
Cardiology, European Cardiology Congress); разместить информацию о проекте на сайте организации-заявителя.

Текущие результаты проекта:
Для количественной оценки мутантного аллеля в мтДНК разработан метод количественной оценки степени гетеропламии митохондриального генома с использованием реакции пиросеквенирования. Выявлено девять мутаций в 8 митохондриальных генах, кодирующих рРНК 12S, тРНК-лей, цитохром B, и субъединицы 1, 2, 5 и 6 NADH дегидрогеназы, ассоциированных с атеросклеротическими поражениями.
В пилотных клинических исследованиях установлено, что пять генетических маркеров имеют диагностическую значимость в отношении доклинического атеросклероза. Созданы лабораторные образцы наборов для определения степени гетероплазмии мтДНК по 9 мутациям методом ПЦР-РВ с использованием стандартных TaqMan-зондов. Разработан лабораторный технологический регламент на изготовление гибридизационных LNA-зондов. Созданы лабораторные образцы наборов для определения степени гетероплазмии мтДНК по 4 мутациям методом ПЦР-РВ с использованием LNA-зондов. Разработан лабораторный технологический регламент количественного определения степени гетероплазмии нуклеиновых кислот методом ПЦР-диагностики.

Публикации:
1) Sazonova M, Budnikov E, Khasanova Z, Sobenin I, Postnov A, Orekhov A. Studies of the human aortic intima
by a direct quantitative assay of mutant alleles in the mitochondrial genome. Atherosclerosis. 2009 204(1):
184-190.
2) Chistiakov DA, Sobenin IA, Bobryshev YV, Orekhov AN. Mitochondrial dysfunction and
mitochondrial DNA mutations in atherosclerotic complications in diabetes. World J Cardiol 2012 4(5):148-156.
3) Sobenin IA, Sazonova MA, Postnov AY, Bobryshev YV, Orekhov AN. Mitochondrial mutations are associated
with atherosclerotic lesions in the human aorta. Clin Dev Immunol. 2012; 2012:832464.
4) Sobenin IA, Sazonova MA, Ivanova MM, Zhelankin AV, Myasoedova VA, Postnov AY, Nurbaev SD,
Bobryshev YV, Orekhov AN. Mutation C3256T of mitochondrial genome in white blood cells: novel genetic
marker of atherosclerosis and coronary heart disease. PLoS One 2012 7(10):e46573.
5) Sobenin IA, Sazonova MA, Postnov AY, Bobryshev YV, Orekhov AN. Changes of mitochondria in
atherosclerosis: Possible determinant in the pathogenesis of the disease. Atherosclerosis 2013 227(2):283-288.
6) Sobenin IA, Chistiakov DA, Sazonova MA, Ivanova MM, Bobryshev YV, Orekhov AN, Postnov AY.
Association of the level of heteroplasmy of the 15059G>A mutation in the MT-CYB mitochondrial gene with
essential hypertension. World J Cardiol. 2013 5(5):132-140.
7) Sobenin IA, Sazonova MA, Postnov AY, Salonen JT, Bobryshev YV, Orekhov AN. Association of
mitochondrial genetic variation with carotid atherosclerosis. PLoS One. 2013 8(7):e68070.
8) Sobenin IA, Chistiakov DA, Bobryshev YV, Postnov AY, Orekhov AN. Mitochondrial mutations in
atherosclerosis: new solutions in research and possible clinical applications. Curr Pharm Des. 2013 19(33):
5942-5953.
9) Sobenin IA, Mitrofanov KY, Zhelankin AV, Sazonova MA, Postnov AY, Revin VV, Bobryshev YV, Orekhov
AN. Quantitative assessment of heteroplasmy of mitochondrial genome: perspectives in diagnostics and
methodological pitfalls. BioMed Res Int. 2014 2014:292017.
10) Chistiakov DA, Sobenin IA, Revin VV, Orekhov AN, Bobryshev YV. Mitochondrial aging and age-related
dysfunction of mitochondria. BioMed Res Int 2014 2014:238463.
11) Sobenin I, Bobryshev Y, Romanenko E, Orekhov A. Mutations of mitochondrial genome and atherosclerosis:
possible mechanistic relationship. In: Cardiovascular Disease. iConcept Press, 2014, ISBN: 978-1-922227-28-7
(accepted for publication).