Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка методологии оценки острой токсичности отходов производства и потребления и их безопасности для здоровья человека в системах in vitro с имитацией микроциркуляции

Докладчик: Сахаров Дмитрий Андреевич

Должность: главный научный сотрудник, заведующий лабораторией

Цель проекта:
Цель данного проекта разработка методологии оценки острой токсичности отходов производства и потребления и их безопасности для здоровья человека в системах in vitro с имитацией микроциркуляции, что позволит получить важную информацию о возможных рисках воздействия отходов производства и потребления для здоровья человека и в конечном итоге может быть на правлено на улучшение санитарно-эпидемилогической обстановки и экологической безопасности отходов для здоровья человека. В качестве объекта исследования используется сокультивируемые культуры клеток печени и нервной ткани человека.

Основные планируемые результаты проекта:
1) Клеточные модели тканей человека для оценки токсичности отходов производства и потребления и их безопасности для человека.
2) Протоколы культивирования клеточных моделей в условиях циркуляции клеточной среды.
3) Макет специализированного микрофлюидного биочипа для культивирования клеточных моделей в целях исследования биологической безопасности отходов.
4) Методические рекомендации по оценке острой токсичности отходов производства и потребления и их безопасности для здоровья человека в системах in vitro с имитацией микроциркуляции.
Для достижения поставленных задач планируется проведение исследований острой токсичности компонентов загрязнителей и их комплекса с акцентом на молекулярные механизмы её реализации с использованием клеточных моделей печени на основе клеток линии HepaRG, культивируемых в культуральных планшетах и в условиях микробиореактора, в виде монослоя и трехмерных образований – сфероидов, получаемых методом висячей капли, а также клеточных моделях иных органов, наиболее чувствительных к воздействию токсикантов, отбор которых будет произведен на этапе теоретических исследований.
Для выполнения проекта необходимо обосновать выбор контрольных и исследуемых веществ и их комплексов из наиболее значимых загрязнителей, входящих в состав отходов производства и потребления, а также выбрать разработать метод пробоподготовки для проведения экспериментов по оценки острой токсичности и отходов производства и потребления и их биобезопасности.
В отношении разработки методики в части гепатотоксичности - необходимо разработать и получить экспериментальные образцы клеточных моделей печени человека на основе клеток линии HepaRG и провести сравнительную экспериментальную оценку устойчивости к токсическому воздействию (МТТ-тест, исследование маркеров клеточной гибели клеток (апоптоз, некроз) методами флуоресцентной микроскопии будут) и метаболической активности сопоставимого количества клеток печени, культивируемых в различных условиях, методами количественной аналитической химии – хроматографии и/или масс-спектрометрии. Предполагается исследование динамических параметров (не менее трех точек) изменения жизнеспособности клеток и изменения концентрации тестируемого вещества в результате его биотрансформации.
Планируется получение экспериментальных модели печени человека на основе не менее трех серий сфероидов различных размеров с оценкой степень корреляции показателей жизнеспособности клеток и активности процессов биотрансформации тестируемых веществ (по изменении их концентрации в питательной среде) и размеров сфероидов.
Методами иммуногистохимии будут охарактеризованы уровни экспресии основного цитохрома CYP3A4 и транспортера P-гликопротеина, а методами ПЦР исследована экспрессия основных ферментов семейства цитохрома Р-450 (CYP3A4, CYP1A2, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 и CYP2E1) и транспортера Р-гликопротеина в сфероидах различного размера и монослое, в том числе после воздействия стандартных ингибиторов и стимуляторов и химических аналогов-веществ, наиболее значимых компонентов отходов производства и потребления.
Таким образом, ожидается получение различных характеристик тест-объекта для обоснования способов интерпретации получаемых результатов.
С целью исследования особенности биотрансформации и токсичности тестируемых веществ в разработанной модели печени человека на основе клеток линии HepaRG культивируемых в виде сфероидов в условиях имитации микроциркуляции необходима разработка модели и образца микробиореактора, обеспечивающего микроциркуляцию, подходящих для проведения исследований токсичности отходов производства и потребления.
Далее планируется изучение структурных и функциональных особенностей клеток печени в различных локусах сфероидов (центральная и краевая зоны) в зависимости от размеров полученных моделей методами иммунофлуоресцентного анализа при культивации в виде сфероидов в условиях имитации микроциркуляции.
Необходимо исследование степени проницаемости сфероидов различного размера для тестируемых вещества. На примере отдельных веществ, наиболее значимых компонентов отходов производства и потребления, методом флуоресцентной микроскопии будет оценена способность к проникновению вглубь сфероидов различных диаметров (не менее 3) при культивации в виде сфероидов в условиях имитации микроциркуляции.
Результаты проведённых исследования будут использованы для выбора оптимальной клеточной модели печени человека с целью изучения процессов биотрансформации и токсичности тестируемых средств и их комбинаций в условиях in vitro.
На основании данных теоретических исследований будет отобрано не менее двух иных органов мишеней, в отношении которых буду сформированы и охарактеризованы клеточные модели, пригодные для применения в рамках разработанной методики.
Предполагается разработка макета специализированного биочипа для обеспечения методики исследования токсичности тестируемых средств и их комбинаций в условиях in vitro с использованием нескольких клеточных моделей.
Так же будет проведено сравнение информативности разработанной модели в части количественного и качественного соответствия результатов данным, полученным в исследованиях in vivo.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Основные пути использования ожидаемых результатов НИР:
1. Изучение гепатотоксических эффектов отдельных загрязняющих веществ и их смесей входящих в состав отходов производства и потребления;
2. При санитарно-гигиеническом нормировании и обосновании безопасных уровней содержания химических веществ и их смесей;
3. При обосновании классов опасности отходов в системе обеспечения экологической безопасности на промышленных предприятиях, уменьшение доли исследований на лабораторных животных;
4. Исследования интегральной токсичности воды, водных вытяжек почвы и воздуха, природных и хозяйственно-бытовых вод для оценки рисков здоровью человека;
5. Технолого-биологический контроль качества природоохранных мероприятий и процессов очистки сбросов и выбросов в окружающую среду.
Возможные потребители ожидаемых результатов:
Потенциальными целевыми потребителями научных и научно-технических результатов НИР использованием длительно культивируемых клеток:
- НИИ и лаборатории и т. п. организации и учреждения, осуществляющие определение предельно допустимых концентраций и ориентировочно безопасных уровней содержания химических веществ в воде;
- организации санитарно-эпидемиологической службы, обеспечивающие токсикологическую безопасность воды, используемой на нужды населения;
- лаборатории, осуществляющие определение классов опасности жидких отходов;
- промышленные предприятия, осуществляющие реализацию международных стандартов по обеспечении экологической безопасности при определении токсичности для здоровья персонала образующихся промышленных отходов.
Основные целевые потребители разрабатываемой научно-технической продукции - промышленные предприятия металлургической, химической, нефте-газовой, энергетической, атомной промышленности и предприятия наноиндустрии, предприятия хозяйственного-бытового сектора. Разработанные методики при применении на предприятиях могут являются частью реализации международных стандартов по обеспечении экологической безопасности (ISO 14000) при определении токсичности образующихся отходов производства и потребления для здоровья населения и работающего персонала.
Согласно нормативно-правовым актам по обеспечению экологической безопасности на каждом промышленном предприятии необходима оценка токсичности при определении класса опасности выделяемых предприятием отходов, в том числе сточных вод и оценка токсичности отходов при определении рисков для здоровья персонала и населения импактных зон. При этом частота проведения такой оценки зависит от сферы деятельности и санитарно-эпидемиологических рисков производимых отходов для здоровья населения и может достигать ежедневной повторяемости. Однако на более чем половине предприятиях выделяющих в окружающую среду отходы отсутствуют достаточно оснащенные лаборатории, осуществляющие токсикологические исследования.
Разработанная методология и оборудование могут быть внедрены в систему экологической безопасности на промышленных предприятиях, что позволит проводить более точный контроль рисков для здоровья населения и персонала, а так же прогнозировать возможные негативные последствия при техногенных катастрофах, связанных с загрязнением окружающей среды.

Текущие результаты проекта:
В ходе выполнения проекта поучена вспомогательная клеточная модель для разработки методики оценки токсичности представленная 3D моделями печени человека в виде сфероидов клеток линии HepaRG. В ходе экспериментальных исследований разработан оптимальный размер и количество сфероидов методами цитофлюрометрического анализа. Так например, в сфероидах состоящих из 50 тыс. клеток в центре наблюдаются области некроза. Оценена метаболическая активность и жизнеспособность клеток в условиях циркуляции питательной среды и в статических условиях методами ПЦР, и по значениям уровня лактата и глюкозы.
Для исследования информативности выбрано в качестве контрольного вещества – пестицид изофенфос, метаболизируемый клетками печени человека с образование веществ способных ингибировать ацетилхолинэстеразу в нервных клетках. Исследована скорость его метаболизма в клетках печени в условиях циркуляции питательной среды и в статических условиях при культивировании при 24, 48 и 72 часах инкубации.
На данном этапе разработана функционально-активная трехмерная модель печени человека пригодная для сокультивирования с клетками нервной ткани на дальнейших этапах.