Регистрация / Вход
Прислать материал

Создание прогностической тест-системы для оценки риска развития и персонализации подходов к терапии широко распространенных онкологических заболеваний на основе изучения генетических и эпигенетических механизмов опухолевого роста

Номер контракта: 14.574.21.0026

Руководитель: Хуснутдинова Эльза Камилевна

Должность: Зав. кафедры генетики и фундаментальной медицины

Организация: федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Башкирский государственный университет"
Организация докладчика: федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Башкирский государственный университет"

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
рак яичников, рак предстательной железы, рак желудка, метилирование днк, полногеномное секвенирование экзома

Цель проекта:
К настоящему времени известно, что многие онкологические заболевания (в том числе изучаемые в рамках проекта – рак желудка, рак яичников, рак предстательной железы) включают в себя несколько гистологических типов, обладающих существенными генетическими и эпигенетическими особенностями, которые связаны с различиями в этиологии опухолей. Большое значение для понимания различных аспектов этиологии рака играют технологии секвенирования следующего поколения (NGS), которые позволяют осуществлять глубокий анализ целого генома, метилома или экзома человека. Знание молекулярно-генетических и эпигенетических особенностей опухоли является основой определения прогностических маркеров риска, направленных на диагностику заболевания и прогнозирование тяжести течения патологии, а также открывает большие возможности для разработки таргетной терапии онкологических больных, обладающей высокой эффективностью. Между тем, несмотря на значительные достижения в области исследований онкологических заболеваний, их ранняя диагностика и лечение, установление новых маркеров, создание диагностических панелей молекулярных маркеров, обладающих высокой точностью и специфичностью, способных предсказать агрессивность опухоли и прогноз течения заболевания у конкретного пациента, по-прежнему является актуальной проблемой, необходимой для раннего обнаружения злокачественных изменений, проведения скрининга в популяциях с целью выявления предрасположенности к развитию указанных онкопатологий, а также прогнозирования течения заболевания и принятия терапевтических решений. Целью данного проекта является разработка экспериментального образца прогностической тест-системы для оценки риска развития заболеваний, опухолевой прогрессии, вероятности возникновения рецидива и персонализации подходов к терапии рака яичников, рака желудка и предстательной железы, включающих комплекс мутаций и маркеров метилирования ДНК.

Основные планируемые результаты проекта:
В ходе выполнения проекта ожидается получение следующих результатов:
Определение спектра и частоты изменений нуклеотидной последовательности в кодирующей части генома (экзом) и определение полногеномного профиля метилирования CpG-областей (метилом) в образцах ДНК, выделенных из нормальной и опухолевой ткани больных раком яичника, предстательной железы и желудка;
Разработка и изготовление комплексного макета прогностической тест-системы для оценки риска развития заболевания, опухолевой прогрессии, вероятности возникновения рецидива и персонализации подходов к терапии рака яичников, рака предстательной железы и рака желудка.
В целом, данное исследование даст возможность более детально охарактеризовать генетическую предрасположенность к развитию рака желудка, рака предстательной железы и рака яичников, а также поможет в будущем разработать профилактические мероприятия и индивидуальные рекомендации по изменению тактики лечения, позволяющей минимизировать риск развития осложнений при лечении подобных заболеваний.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
В ходе выполнения проекта разработан макет комплексных прогностических тест-систем детекции генетических маркеров, выявленных с помощью секвенирования экзома и метилома на основе технологии ПЦР в реальном времени, которые рекомендуется использовать при создании соответствующих диагностических наборов для применения в лабораторной диагностике в качестве готовых коммерческих продуктов. Разработанные тест-системы позволяют определять мутации, ассоциированные с риском развития широко распространенных онкологических заболеваний (рак яичников, рак предстательной железы и рак желудка). Также в результате выполнения проекта отобраны генетические изменения, которые можно использовать для создания системы панелей маркеров при разработке диагностических биочипов формата 8-16-24-32-64-96 точек детекции. Принцип, по которому были отобраны генетические изменения для разработки макета тест-систем и диагностической панели маркеров, обладает научной новизной, поскольку они получены в ходе обширного комплексного методологического подхода, включающего тщательный клинический осмотр больных, забор от каждого пациента гистологически разных видов тканей - нормальной и опухолевой, NGS-секвенирование экзома и метилома в геномной ДНК в обоих видах тканей, расширенный биоинформатический анализ.
Выбранный методологический принцип по исследованию изученных видов онкопатологий, отбору и выбору генетических изменений при разработке макета прогностических тест-систем и диагностической панели маркеров, а также биоинформатический подход для обработки данных, полученных после секвенирования экзома и метилома, и все используемые инструменты для биоинформатического анализа данных соответствуют международному уровню и выполнены со всеми требованиями, предъявляемыми к подобного рода анализам.
При реализации проекта по производству тест-систем (наборов) можно выделить следующие виды рисков: рыночные, производственные, финансовые и научные. К рыночным факторам риска можно отнести наличие разработок конкурентов, невысокий спрос на российском рынке на диагностические тест-системы для определения наследственных заболеваний. Степень оценки риска - средняя. К производственным факторам риска можно отнести возможность увеличения себестоимости конечного продукта на начальной стадии производства и возможность задержки по срокам освоения производства. Степень оценки риска - средняя. К финансовым факторам риска относится возможность несвоевременного софинансирования проекта возможных инвесторов. Степень оценки риска - минимальная.
Способами стимулирования продаж может быть демонстрация результатов тест-системы на профильных конференциях, представление бесплатных тестовых образцов клинико-диагностическим лабораториям и др.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Разработанные тест-системы по детекции мутаций, ассоциированных с риском развития широко распространенных онкологических заболеваний (рак яичников, рак предстательной железы и рак желудка), рекомендуется использовать в лабораторной практике при медико-генетическом консультировании, коммерческих диагностических центрах, лабораториях и клиниках. Полученные результаты по анализу и исследовательскому отбору генов-кандидатов изученных онкопатологий (рак яичников, рак предстательной железы и рак желудка) рекомендуется использовать также для создания систем панелей генетических маркеров для разработки диагностических биочипов формата 8-16-24-32-64-96 точек детекции. В целом данные полногеномного секвенирования экзома и метилома в образцах ДНК, выделенных из нормальной и опухолевой ткани больных раком яичников, раком предстательной железы и раком желудка являются хорошей основой для поиска новых информативных генетических маркеров, характеризующих клинически значимые биологические особенности опухолей.
Результаты данного исследования рекомендуется внедрить в научно-образовательный процесс для обучения студентов медицинского и естественно-научного профиля для разработки курсов лекций, спецкурсов, практикумов по молекулярной генетике человека («Молекулярная медицина», «Биоэтика», «Методы молекулярной генетики», «Этногеномика», «Протеомика», «Физиологическая генетика»), как составной части учебных программ по подготовке специалистов в области медицины, физико-химической молекулярной биологии, биотехнологии, в том числе для программ послевузовского образования. Также результаты проекта предлагается использовать при подготовке диссертаций на соискание ученых степеней кандидатов и докторов наук, для налаживания научных межпредметных связей и интеграции учреждений науки, высшего профессионального образования и медицинских учреждений.


Текущие результаты проекта:
Проведено секвенирование экзома в парных образцах геномной ДНК (N=48), выделенных из нормальной (n=24) и опухолевой ткани (n=24) у больных широко распространенными онкологическими заболеваниями: раком яичника (n=8), раком желудка (n=8) и раком предстательной железы (n=8). Все последовательности (риды) выровнены на референсный геном с использованием программы Burrows-Wheeler Alignment (BWA). В качестве референсной была выбрана последовательность генома человека (Genome Reference Consortium Human Build 37 (GRCh37-hg19). Обнаруженные варианты аннотировались с помощью программы ANNOVAR с использованием summarize_annovar.pl script (Wang et al, 2010), позволяющей сравнивать однонуклеотидные замены, полученные в результате секвенирования, с рядом специализированных баз данных и аннотировать предсказательную функциональную значимость выявленных изменений с использованием шести in silico инструментов (SIFT, PolyPhen-2, LRT, MutationTaster, phyloP и GERP++) из dbNSFP v.1.3 (Liu et al, 2011). Аннотация клинических вариантов была получена из базы данных NCBI ClinVar (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/).
В результате экзомного секвенирования образцов ДНК из нормальной ткани яичников (n=8) обнаружено в среднем 53057 изменений на один образец, из опухолевой ткани (n=8) – 57734 изменения. При анализе результатов секвенирования экзома образцов ДНК из нормальной ткани установлено, что 44% изменений расположены в кодирующих областях генома, 55,8% – в интронных участках, 0,2% – в сайтах сплайсинга. Из обнаруженных изменений 0,4% являются мутациями, приводящими к образованию преждевременного стоп-кодона, 0,6% – мутациями, приводящим к сдвигу рамки считывания, 51% – синонимичными заменами, 47% – несинонимичными заменами, 0.5% – инсерциями, 0,5% – делециями.
В образцах ДНК из опухолевой ткани больных раком яичников в экзонных областях выявлен 41% изменений, в интронах – 58,8%, в сайтах сплайсинга – 0,2%. Из обнаруженных изменений 0,3% являются мутациями, приводящими к образованию преждевременного стоп-кодона, 0,7% – мутациями, приводящими к сдвигу рамки считывания, 49% – синонимичными заменами, 49% – несинонимичными заменами, 0,5% – инсерциями, 0,5% – делециями.
В результате секвенирования экзома образцов ДНК, выделенных из опухолевой и прилежащей к ней нормальной ткани желудка больных раком желудка (РЖ) на один образец в среднем выявлено 33134 изменений нуклеотидной последовательности в нормальной ткани (среди которых 3,3% составили мутации, приводящие к сдвигу рамки считывания, 40,0% - несинонимичные замены, 0,3% - мутации, приводящие к образованию стоп-кодонов) и 33980 – в опухолевой ткани (среди которых 3,3% составили мутации, приводящие к сдвигу рамки считывания, 37,1% - несинонимичные замены, 0,4% - мутации, приводящие к образованию стоп-кодона).
В результате секвенирования экзома у пациентов с раком предстательной железы обнаружено в среднем 41542 изменений на один образец в нормальной ткани, 45948 – в опухолевой ткани. При анализе результатов секвенирования экзома образцов ДНК из нормальной ткани установлено, что 43% изменений расположены в кодирующих областях генома, среди них 0,2% составляют мутации, приводящие к образованию стоп-кодонов, 0,3% – мутации сдвига рамки считывания, 21% – синонимичные замены, 18% - несинонимичные замены, по 0,2% – инсерции и делеции. В образцах ДНК из опухолевой ткани 0,2% являются мутациями, приводящими к образованию преждевременного стоп кодона, 0,4% – мутациями, приводящим к сдвигу рамки считывания, 20% – синонимичными заменами, 18% –несинонимичными заменами, 0.25% – инсерциями, 0.28% – делециями.
Для поиска соматических мутаций в образцах ДНК, выделенных из опухолевой ткани, использовали наиболее информативную базу данных по мутациям при онкологических заболеваниях – COSMIC (catalog of somatic mutations in cancer) . Кроме того, для определения надежности выявленных соматических мутаций использовали несколько биоинформатических подходов – для исключения герминальных изменений обнаруженные варианты были отфильтрованы по базам данных dbSNP132 и Genome Project 1000. Для идентификации событий, связанных с опухолью, мы исключили варианты, присутствующие в базах данных dbSNP и 1000Genomes с частотой более 1%. Отбор наиболее значимых соматических мутаций из всего пула изменений проводили, определяя функциональную значимость выявленных генетических вариантов. В первую очередь рассматривались изменения, приводящие к потери функции белка – транкирующие варианты (мутации сдвига рамки считывания (frameshift) и мутации, приводящие к образованию преждевременного стоп кодона). Такие изменения были подтверждены секвенированием по Сенгеру.
В ходе выполнения проекта также проведен высокопроизводительный анализ метилирования методом полногеномного бисульфитного NGS-секвенирования по технологии RRBS (reduced representation bisulfite sequencing) для всех запланированных образцов (N=48), выявлены дифференциально метилированные регионы генома и установлен характер распределения патологически значимых участков метилирования в проекции на гены и внегенные CpG-обогащенные участки генома. Проведена оценка отобранных маркеров с использованием базы данных по метилированию образцов Cancer Genome Atlas. В результате исследования при раке яичников в подавляющем большинстве опухолей наблюдалось гиперметилирование генов CCL21, SPARCL1 и RAB25. Кроме того, в некоторых образцах опухолей было отмечено гиперметилирование промоторов генов BRCA1, MLH1, TMS1. При раке желудка дифференциально метилированные регионы выявлены в генах MLH1, P16, PRDM2, CDKN1C. При раке предстательной железы генами, содержащими наиболее значимо дифференциально метилированные регионы в опухолях по сравнению с нормой, являлись GFI1, ABCG5, SPG20, AOX1, CSDE1.
В результате комплексного анализа данных секвенирования экзома и полногеномного бисульфитного NGS-секвенирования метилома для каждого исследованного онкологического заболевания (рак яичника, рак желудка, рак предстательной железы) выбраны по 32 гена, содержащих патогенные изменения, ассоциированные с генетическими и эпигенетическими механизмами развития данных патологий.
При раке яичников это гены, вовлеченные в контроль клеточного цикла (SCGB3A1, SMAP1, CORO1C, RPS6KA2, REV3L, ZC3H14, FANCC), апоптоз (SCGB3A1, NBEAL1, OSGIN1, ATXN3, FANCC, RPS6KA2, CORO1C), репарацию ДНК (FANCC, RAD17, STX10, NBEAL1), инвазию, пролиферацию, рост раковых клеток (SCGB3A1, CXCR3, AGBL2, FAM83A, MYH14, PA2G4, MKNK2, MUC16, LAPTM4B, RSU1, MMP1, BAGE), а также иммунный ответ (ITIH2, LILRA1, SMAP1, KIR3DL1, IRAK1BP1, IL32, ICAM3, HLA-DRB1, HLA-DQA1, KIR2DS4).
При раке желудка – гены, кодирующие белки, участвующие в процессах ремоделирования хроматина (ARID1A, MLL3, MLL, ARID1B), регуляции клеточного цикла, апоптоза (TP53, P16, TP53INP1, TP53AIP1, TP53I13, CACNA1G, PCDH10, PCDH17, SEPT9, CDKN1C, MCM10), процессах клеточной адгезии, инвазии и миграции (CDH1, TIMP3, FAT4, TSP1, CDH10 UNC5C, SPINT2), а также вовлеченные в процессы клеточного роста и дифференцировки (HOX1A, PDGFRA, NDRG2), репарации (BRCA1, MGMT, MLH1), регуляции транскрипции (CDH5, RUNX3, ATF1, SMAD4).
При раке предстательной железы – онкогены и гены супрессоры опухолевого роста ССDC6, ROS1, CDK11A; гены, принимающие участие в контроле клеточного цикла и апоптозе (NOTCH1, LASP1, MAPK13, NRG1, CEP110, CCND3, FOXO3, CASC5, PDE4DIP, NRG1, MLF1, AMACR), ген, участвующий в Notch-сигнальном пути (MAML3), процессах клеточного роста и дифференцировки (CDH11, RNF43, PAX5, MUC16, MYO5A), репарации и контроле транскрипции (MLH1, APOA1BP, BRCA1, ATM, SLC45A2, HOXC11), процессах окисления (SOD1, AMACR), ремоделирования хроматина (PADI4), репликации ДНК (PRIM2) и иммунном ответе (LILRA4, MYH15).
Также была проведена оценка диагностической и прогностической значимости выбранных локусов на суммарной выборке больных (n=100) раком яичников, раком желудка и раком предстательной железы и группе здоровых индивидов (n=100) в рамках разработки лабораторной методики оценки риска развития онкологических заболеваний на примере рака яичников, рака предстательной железы и рака желудка.
Таким образом, в результате проведенного анализа отобраны наиболее значимые и часто встречающиеся патогенные мутации, на основании которых разработан макет тест-системы для оценки риска развития широко распространенных онкологических заболеваний и проведены испытания по разработанной программе и методикам испытаний.