Разработка технологии послеоперационного мониторинга метастатического опухолевого роста путем анализа неклеточной свободно циркулирующей ДНК крови

свободная днк, свободно-циркулирующая днк, рак, метастазы, мониторинг, персонализированная медицина, молекулярная диагностика, количественная пцр, мутации, перестройки днк

Разработка методических подходов для персонифицированной ранней диагностики образования метастазов первичной опухоли и создание технологии производства индивидуального диагностического теста для максимально доступного, экономически приемлемого и неинвазивного мониторинга развития метастазов опухоли на основе анализа неклеточной свободно циркулирующей ДНК крови пациента. Разрабатываемый диагностический тест должен быть предназначен для персонифицированного анализа свободно-циркулирующей ДНК пациента на предмет ранней диагностики метастатического роста, при использовании его в лабораторных условиях.

Для разработки принципов создания персонифицированных диагностических наборов для послеоперационного мониторинга наличия развития метастазов первичной опухоли у онкологических больных решено несколько подзадач:
1. Разработан способ выделения сцДНК из крови, позволяющий свести минимизировать загрязнение клеточным генетическим материалом, при сохранении количества и качества полученного материала.к минимуму потери сцДНК, и гарантировать наибольшую ее целостность и сохранность; разработать способ точной оценки концентрации сцДНК
2. Разработаны методологические принципы и информационные аналитические инструменты для обработки данных секвенирования биопсийного и/или послеоперационного образца опухоли, позволяющие с высокой степенью надежности идентифицировать соматические мутации ДНК характерные для исследуемой опухоли, которые в дальнейшем будут использоваться для оценки состояния больного
3. Разработаны алгоритмические процедуры и программное обеспечение позволяющее в автоматическом режиме выявить соматические мутации наиболее характерные для исследуемой опухоли и оптимальные с точки зрения дизайна праймеров для количественной ПЦР, а также осуществить дизайн этих праймеров.
4. Выработаны рекомендации для практического применения разработанной тест-системы. Определить необходимую периодичность прохождения больным тестирования, а так же пороговые значения анализов, свидетельствующие о необходимости более полного обследования.

В результате выполнения проекта «Экспериментальные исследования методов послеоперационного мониторинга метастатического опухолевого роста путем анализа неклеточной свободно циркулирующей ДНК крови» разработана методика определения мутаций ДНК, характерных для опухоли и отбора тех мутаций, которые будут использоваться в дальнейшем как биомаркеры для систематического мониторинга сцДНК пациента с целью ранней диагностики метастазирования и/или рецидива опухоли, дизайн и технологию получения набора реагентов для персонифицированной диагностики метастазирования, программу и методики исследовательских испытаний экспериментальных образцов набора реагентов и проб ДНК, методические указания по обработке и интерпретации результатов исследования для ранней диагностики метастатического роста.. По результатам этапа подготовлены и приняты к публикации две научные статьи в журнале, индексируемом в базах данных Web of Science и Scopus; представлены доклады на конференции.
Для секвенирования исходного образца (опухоли) использован секвенатор производства фирмы Life Technologie (США) Ion Torrent PGM и набор праймеров HotSpot Cancer Panel для целевого ресеквенирования кодирующих последовательностей (экзонов) наиболее значимых онкогенов и первичного анализа генетического материала опухоли. Последовательности ДНК из опухолевого образца почки сравниваютcя с ДНК из здоровой ткани для установления индивидуального профиля соматических перестроек, характерных только для данного пациента и данной опухоли. Выделение сцДНК является одним из критических этапов данного проекта. Для получения достоверных количественных данных мы оптимизировали существующие подходы выделения сцДНК с целью минимизировать загрязнение сцДНК фракции генетическим материалом из ядерных клеток крови (лейко- и лимфоцитов). Данные тестирования будут рассмотрены и проанализированы в сочетании с данными других, более традиционных, методов обследования, а также с учетом проводимых курсов радио- и химиотерапии.

Областью применения разрабатываемого продукта является клиническая молекулярная диагностика. Для мониторинга патологических изменений в свободно-циркулирующей ДНК пациента используется стандартный набор оборудования и общелабораторных реактивов молекулярно-диагностической лаборатории. Ввиду распространенности лабораторий, производящих диагностику на основе полимеразной цепной реакции, конечный продукт – набор реактивов для персонифицированной диагностики - потенциально не имеет территориальных ограничений по использованию.
Ввиду принципиального отличия от имеющихся на данный момент методики, более высокой надежности результатов и точности прогнозов, предлагаемый метод диагностики обладает большей привлекательностью как для компаний, оказывающих услуги молекулярной диагностики (низкая себестоимость анализа, гарантированная повторность проведения анализа – пациент будет проходить анализ периодически в одном и том же учреждении), так и для пациента (больший срок от момента диагноза до развития метастазов, что позволит с большей вероятностью купировать патологию).
Ввиду универсальности и масштабируемости предлагаемого метода, возможна дальнейшая его экстраполяция не только на онкологические заболевания, но и на другие социально-значимые патологии. Свободно-циркулирующая ДНК является универсальным биомаркером, с помощью которого можно оценивать предрасположенность к сахарному диабету, а так же ранние стадии прогрессии нейродегенеративных заболеваний.
Разрабатываемый продукт имеет высокую социальную значимость и, при надлежащем внедрении, может существенно изменить показатель смертности от метастазов среди онкологических больных. Послеоперационный мониторинг производится с помощью методик, не позволяющих своевременно выявить начало метастазирования. Предлагаемая методика анализа позволит резко снизить смертность от метастазов среди больных, прошедших курс лечения, и продолжающих отслеживать состояние заболевания после операции. Созданные в рамках данного проекта методики отбора перестроек в ДНК, методики выделения сцДНК, а так же общая инновационная концепция персонифицированной диагностики метастазирования являются объектами интеллектуальной собственности и нуждаются в соответствующей патентной защите ввиду своей уникальности и отсутствия аналогов как в России, так и за рубежом.

Последовательности ДНК из опухолевого образца почки сравниваются с ДНК из здоровой ткани для установления индивидуального профиля соматических перестроек, характерных только для данного пациента и данной опухоли. Далее нами разрабатывается персонифицированный набор праймеров (около 10 пар) для проведения количественной полимеразной цепной реакции для определения концентрации опухолевой ДНК, т.е. фрагментов ДНК, несущих характеристические мутации в неклеточной свободно циркулирующей ДНК крови. Выделение сцДНК является одним из критических этапов данного проекта. Для получения достоверных количественных данных мы оптимизировали существующие подходы выделения сцДНК с целью минимизировать загрязнение сцДНК фракции генетическим материалом из ядерных клеток крови (лейкоцитов и лимфоцитов). Нами произведено сравнение ряда коммерчески доступных наборов для выделения ДНК (как отечественных, так и зарубежных производителей) и установлен наиболее подходящий (обеспечивающий наибольшую концентрацию и целостность сцДНК с минимальным уровнем контаминации клеточной ДНК). Нами сформирована когорта первично-оперированных пациентов, страдающих раком различной локализации, у которых будет производится мониторинг концентрации мутантных аллелей в сцДНК крови. Данные тестирования рассмотрены и проанализированы в сочетании с данными других, более традиционных, методов обследования, а также с учетом проводимых курсов радио- и химиотерапии. Разрабатываемый продукт имеет высокую социальную значимость и, при надлежащем внедрении, может существенно изменить показатель смертности от метастазов среди онкологических больных. Послеоперационный мониторинг производится с помощью методик, не позволяющих своевременно выявить начало метастазирования. Предлагаемая методика анализа позволит резко снизить смертность от метастазов среди больных, прошедших курс лечения, и продолжающих отслеживать состояние заболевания после операции. Созданные в рамках данного проекта методики отбора перестроек в ДНК, методики выделения сцДНК, а также общая инновационная концепция персонифицированной диагностики метастазирования являются объектами интеллектуальной собственности и нуждаются в соответствующей патентной защите ввиду своей уникальности и отсутствия аналогов как в России, так и за рубежом.
Разработаны методика определения мутаций ДНК как биомаркеров для систематического мониторинга сцДНК пациента с целью ранней диагностики метастазирования и/или рецидива опухоли, методика дизайна комплекта ПЦР праймеров, проведены испытания экспериментальных образцов набора реагентов для персонифицированной диагностики, разработан программный комплекс анализа результатов секвенирования ДНК и дизайна праймеров и программная документация на него. Исполнители проекта опубликовали 2 работы в рецензируемых научных изданияхи участвовали в 3 конференциях и симпозиумах по клинической и фундаментальной онкологии с тезисами и докладами, полученными в рамках исполнения данного соглашения.