Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка экспрессионной системы на основе генов антистрессовой устойчивости дрожжей Yarrowia lipolytica

Номер контракта: 14.574.21.0031

Руководитель: Дерябина Юлия Ивановна

Должность: заведующий лабораторией

Организация: федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Курский государственный университет"
Организация докладчика: федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Курский государственный университет"

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
yarrowia lipolytica, антистрессовый ответ, протеомика, интегративная генетическая система, транскрипционные репортеры

Цель проекта:
Цель проекта: Разработка экспрессионной системы с использованием генов антистрессовой устойчивости дрожжей Yarrowia lipolytica, обеспечивающей возможность получения эффективной кормовой добавки на основе дрожжей, ферментируемых на низкосортном сырье (рыбной и мясокостной муке с превышением ПДК по микотоксинам). Основные задачи проекта: 1. Идентифицировать гены антистрессовой устойчивости у Y. lipolytica с применением методов протеомики в условиях утилизации грубых гидрофобных субстратов. 2. Сконструировать экспрессионную систему для дрожжей Y. lipolytica на основе вновь обнаруженных генов антистрессовой устойчивости. 3. Провести испытания экспрессионной системы для Y. lipolytica на основе вновь обнаруженных генов антистрессовой устойчивости. В настоящее время применение стимуляторов роста на животноводческих предприятиях приобрело массовый характер и является важнейшим фактором снижения себестоимости продукции, обеспечения ее конкурентоспособности в условиях быстрого роста производства, ввиду этого уникальные физиологические особенности Y. lipolytica могут быть использованы для решения практических задач, состоящих в конструировании новой системы доставки биологически активных пептидов животным. Исключительная дешевизна производства биомассы этого вида дрожжей позволяет обеспечивать доступность препарата для массового использования, в том числе, в высоких дозировках.

Основные планируемые результаты проекта:
В результате проведенных исследований:
должна быть выполнена оценка молекулярно-генетических механизмов антистрессовой адаптации экстремофильных дрожжей Y. lipolytica в условиях утилизации грубых гидрофобных продуктов (рыбной и мясокостной муки с превышением ПДК по микотоксинам);
должны быть созданы рекомбинантные штаммы с высокой транскрипционной активностью промоторов индуцибельных генов антистрессовой адаптации и сконструирована эффективная генетически стабильная экспрессионная система для экстремофильных дрожжей Y. lipolytica на основе идентифицированных генов антистрессового ответа;
должна быть получена и протестирована на кормовую эффективность кормовая добавка на основе дрожжей Y. lipolytica, ферментируемых на экономически доступном сырье;
должно быть проведено испытание на острую и субхроническую токсичность кормовой добавки на основе дрожжей Y. lipolytica, ферментируемых на экономически доступном сырье (рыбной и мясокостной муке с превышением ПДК по микотоксинам).

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
1. Получены интегративные плазмидные конструкции, предназначенные для экспрессии репортёрного гена LacZ из E. coli под контролем промоторов генов антистрессовой адаптации Y. lipolytica: VDAC, CPY, NAA и KGDH в рекомбинантных штаммах дрожжей Y. lipolytica. Сконструированы банки случайных пептидов в N-концевом положении репортёрного белка, экспрессируемого в интегративной системе с помощью промоторов генов антистрессовой адаптации с использованием сигнала репортёрного гена в условиях культивирования Y. lipolytica.
Проведен скрининг банка случайных пептидов на увеличение репортёрного сигнала за счёт стабилизации репортёрного белка в клетках Y. lipolytica N-концевым пептидом. Исследована генетическая стабильность интегративной системы в условиях культивирования Y. lipolytica на различных видах низкосортного сырья. Изучена генетическая стабильность и эффективность экспрессии репортёрного гена LacZ при культивировании рекомбинантных штаммов на низкосортном промышленном сырье: рыбной и мясокостной муке с превышением ПДК по афлотоксинам. Показана способность рекомбинантных штаммов, несущих интегративные плазмидные конструкции, предназначенные для экспрессии репортёрного гена LacZ из E. coli под контролем промоторов генов антистрессовой адаптации Y. Lipolytica - VDAC, CPY, NAA и KGDH - осуществлять биоконверсию низкосортного промышленного сырья (рыбной и мясокостной муки с превышением ПДК по афлотоксинам) в биодобавку «Ярролипин».
2. Полученные результаты являются абсолютно приоритетными.
3. Проведенные исследования находятся на передовом научно-методическом уровне, что определяет высокое качество результатов на мировом уровне.
4. Пути достижения полученных результатов предусматривают: 1) выбор и клонирование генов Y. lipolytica, наиболее эффективно экспрессирующихся при культивировании дрожжей на гидрофобных субстратах; 2) конструирование на основе клонированных генов Y. lipolytica замещающей интегративной генетической системы; 3) получение на базе сконструированной интегративной системы тестерных конструкций с генами-репортёрами; 4) получение рекомбинантных штаммов Y. lipolytica, содержащих тестерные конструкции с генами-репортёрами с последующим исследованием уровня транскрипционной активности промоторов генов антистрессовой адаптации с использованием сигнала репортёрного гена в условиях культивирования Y. lipolytica на различных видах низкосортного сырья (рыбной и мясокостной муки с превышением ПДК по микотоксинам); 5) конструировании банков случайных пептидов в N-концевом положении репортёрного белка, экспрессируемого в интегративной системе с помощью промоторов генов антистрессовой адаптации с использованием сигнала репортёрного гена в условиях культивирования Y. lipolytica; 6) скрининге банка случайных пептидов на увеличение репортёрного сигнала за счёт стабилизации репортёрного белка в клетках Y. lipolytica N-концевым пептидом; 7) исследовании генетической стабильности интегративной системы в условиях культивирования Y. lipolytica на различных видах экономически доступного сырья.


Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
1. Полученные результаты можно с успехом применять в интересах фундаментальной науки в качестве рекомендаций для построения модельных систем клеточного метаболизма липидов, что может представлять интерес для биоэнергетики, сельского хозяйства, селекции с целью получения новых более продуктивных сортов масличных растений и/или создание новых штаммов промышленных микроорганизмов. Результаты заявляемой работы могут быть полезны для создания и оптимизации протоколов очистки богатых жировыми компонентами сточных вод пищевых производств (например, оливкового и пальмового масел), включающих стадию биодеградации с применением штаммов Y. lipolytica.
2. Научные разработки, полученные в ходе выполнения работ по проекту, позволят предложить новые технологические приемы для микробиологической обработки промышленных отходов, например, рыбоперерабатывающих отраслей, богатых трудноразлагаемыми жирами, которые могут выполнять роль экономически доступных субстратов для биотехнологического производства различных экстрасекреторных продуктов Y. lipolytica. Кроме того, объектами применения ожидаемых в ходе выполнения ПНИ результатов могут служить биоремедиация водоемов и почв от нефте- и углеводородсодержащих загрязнений, являющихся одной из основных причин экологических катастроф как на суше, так и в водных средах.
3. Ключевым моментом стратегии продвижения полученной продукции на рынок будет являться разработка и регистрация торговой марки, а также разработка упаковки для тест-систем, а также участие в отраслевых конференциях и семинарах.
4. Популяризацию полученных научных разработок планируется проводить в рамках публикации научных материалов в зарубежной литературе и участия в международных конференциях.

Текущие результаты проекта:
Получены интегративные плазмидные конструкции, предназначенные для экспрессии репортёрного гена LacZ из E. coli под контролем промоторов генов антистрессовой адаптации Y. lipolytica: VDAC, CPY, NAA и KGDH в рекомбинантных штаммах дрожжей Y. lipolytica.
Изучена генетическая стабильность и эффективность экспрессии репортёрного гена LacZ при культивировании рекомбинантных штаммов на низкосортном промышленном сырье: рыбной и мясокостной муке с превышением ПДК по афлотоксинам. Показана способность рекомбинантных штаммов, несущих интегративные плазмидные конструкции, предназначенные для экспрессии репортёрного гена LacZ из E. coli под контролем промоторов генов антистрессовой адаптации Y. Lipolytica - VDAC, CPY, NAA и KGDH - осуществлять биоконверсию низкосортного промышленного сырья (рыбной и мясокостной муки с превышением ПДК по афлотоксинам) в биодобавку «Ярролипин».
Сконструированы банки случайных пептидов в N-концевом положении репортёрного белка, экспрессируемого в интегративной системе с помощью промоторов генов антистрессовой адаптации с использованием сигнала репортёрного гена в условиях культивирования Y. lipolytica.
Проведен скрининг банка случайных пептидов на увеличение репортёрного сигнала за счёт стабилизации репортёрного белка в клетках Y. lipolytica N-концевым пептидом. Исследована генетическая стабильность интегративной системы в условиях культивирования Y. lipolytica на различных видах низкосортного сырья.