Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка и подготовка промышленного выпуска амперометрического биосенсорного анализатора для экспресс-определения биохимического потребления кислорода.

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
биохимическое потребление кислорода (бпк), биосенсоры, амперометрия, дрожжи, бактерии, биокатализ, иммобилизация, модифицированные электроды.

Цель проекта:
Учитывая постоянно растущий перечень загрязняющих веществ, поступающих в окружающую среду, а также ужесточение гигиенических показателей их нормирования, полный химический анализ загрязнения вод, почв, растительности представляет собой очень сложную и дорогостоящую задачу. Поэтому возрастающее внимание уделяется экспресс- методам контроля, ориентированным, прежде всего, на детектирование опасных уровней загрязнения и оценку совокупного воздействия токсикантов на окружающую среду. Биохимическое (или биологическое) потребление кислорода (БПК) является одним из наиболее широко используемых показателей для контроля чистоты водных сред, и представляет, по определению, количество кислорода, необходимое для биохимического окисления органических веществ, содержащихся в образце. Существующий метод определения БПК основан на тестах, продолжительность которых составляет 5, 10 или 20 суток (ПНДФ 14. 1:2:3:4. 123-97). В силу значительной продолжительности процедуры метод не является адекватным в современных условиях жизни, поскольку представляет результаты анализа со значительной задержкой (минимум 5 суток от момента поступления пробы). В настоящее время все промышленные предприятия и водоочистные сооружения РФ используют для повседневного рутинного анализа сточных вод упомянутый метод БПК5. Целью выполнения проекта является: получение значимых научных результатов и решение комплекса научно-практических задач, позволяющих создать и в короткий срок вывести на рынок новый вид научно-технической продукции – биосенсорный анализатор для экспресс-определения биохимического потребления кислорода. Основной идеологической задачей проекта является соединение знаний, опыта, имеющегося научного задела и интеллектуальной собственности коллектива исследователей Тульского государственного университета и опыта разработки и организации промышленного выпуска приборов аналогичного назначения коллектива сотрудников ООО «Эконикс-Эксперт». Главной научно-технической задачей проекта является разработка экспериментального образца нового аналитического прибора, предназначенного для экспресс-определения биохимического потребления кислорода в поверхностных пресных, подземных, питьевых и сточных водах. Реализация проекта позволит сократить срок коммерциализации результата до 1,5 – 2 лет, необходимых для проведения сравнительно несложных опытно-технологических работ.

Основные планируемые результаты проекта:
Должен быть выполнен аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей научно-техническую проблему, исследуемую в рамках ПНИ, в том числе обзор научных информационных источников: 11 статьи в ведущих зарубежных и (или) российских научных журналах, монографии и (или) патенты - не менее 15 научно-информационных источников за период 2009 – 2013 гг.
Должны быть выполнены патентные исследования в соответствии с ГОСТ 15.011-96.
Должна быть проведена сравнительная оценка вариантов возможных решений исследуемой проблемы с учетом результатов прогнозных исследований, проводившихся по аналогичной тематике;
Должны быть разработаны методики культивирования используемых микроорганизмов и методики их иммобилизации для изготовления биорецепторных элементов для определения БПК, обеспечивающие высокие характеристики разрабатываемого экспериментального образца биосенсорного анализатора.
Должна быть разработана конструкторская документация на кислородный электрод.
Должна быть разработана методика создания биорецепторного элемента на основе ассоциации микроорганизмов Pichia angusta, Arxula adeninovorans и Debaryomyces hansenii.
Должна быть разработана электрическая схема измерителя-преобразователя.
Должны быть разработаны и изготовлены экспериментальные образцы биосенсорных анализаторов в количестве, достаточном для определения их характеристик (не менее 3 штук).
Должны быть разработаны программа и методики испытаний экспериментального образца биосенсорного анализатора.
Должны быть проведены испытания экспериментального образца биосенсорного анализатора.
Должна быть разработана методика определения БПК с использованием разработанного экспериментального образца биосенсорного анализатора.
На репрезентативной выборке проб должна быть исследована корреляция результатов, получаемых с использованием разрабатываемого экспериментального образца амперометрического биосенсорного анализатора и существующих аналитических/диагностических методов, используемых для решения тех же задач.
Должны быть показаны преимущества разрабатываемого экспериментального образца амперометрического биосенсорного анализатора по сравнению с существующими аналитическими/диагностическими методами, используемыми для решения тех же задач.
Должен быть разработан пакет технической документации на разработанный биосенсорный анализатор в составе: технических условий на прибор, зарегистрированных в Госстандарте, руководства по эксплуатации (проект), методики поверки прибора (проект), описания типа средства измерений (проект).
Должен быть разработан пакет эскизной конструкторской документации на разработанный экспериментальный образец биосенсорного анализатора.
Должно быть проведено обобщение результатов ПНИ, проверка их соответствия требованиям ТЗ, оценка результативности ПНИ и эффективности результатов в сравнении с современным научно-техническим уровнем.
Должны быть проведены работы по подготовке предложений и рекомендаций по реализации (коммерциализации) результатов ПНИ, вовлечению их в хозяйственный оборот.
Должен быть разработан проект ТЗ на проведение ОТР по теме: «Разработка технологии производства биосенсорного анализатора для экспресс-определения биохимического потребления кислорода»

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
В данном проекте предлагается разработка аналитического прибора нового поколения, предназначенного для экспресс-оценки индекса БПК. Принципиальным отличием метода анализа с использованием разрабатываемого прибора от существующего является сокращение времени анализа от 5 суток до 5 - 15 мин. С помощью данного анализатора возможно осуществлять анализ в режиме реального времени, для измерения не требуется привлечения высокоспециализированного персонала. Прибор может использоваться как в стационарных условиях, так и в составе подвижных лабораторий.
В разрабатываемом биосенсоре для экспресс-определения БПК будет содержатся ряд новых элементов, представляющих научную новизну авторов проекта. К ним относятся:
• используемые штаммы микроорганизмов и их ассоциации (возможен подбор микроорганизмов, которые обеспечивали бы наиболее эффективную детекцию БПК в соответствии с типом сточных вод);
• способы формирования рецепторного элемента, обеспечивающие длительное время непрерывного функционирования анализатора (возможен выбор способа иммобилизации микроорганизмов, обеспечивающего необходимые характеристики биосенсора в соответствии с типом сточных вод);
Планируемые к выпуску биосенсорные анализаторы БПК будут основаны на анализаторах жидкости выпускаемых индустриальным партнером - ООО "Эконикс-Эксперт" (г. Москва). ТулГУ будет заниматься разработкой биорецепторных элементов БПК-сенсора. ООО "Эконикс-Эксперт" будет разрабатывать технологическую составляющую анализатора и заниматься доработкой программного обеспечения.
Разработанная сенсорная база обеспечит эффективное применение аналитической аппаратуры в Российской Федерации. Следует отметить, что ее использование в полном масштабе, необходимом для решения практических задач, невозможно реализовать за счет зарубежных закупок. Так стоимость одной из самых популярных моделей БПК биосенсоров «BOD-3300» (Central Kagaku Corp., Япония) составляет более 80 000 долларов США (http://www.aqua-ckc.jp/product2/bod.html#top), планируемая стоимость анализатора, разрабатываемого в проекте около 3000 долларов США. Однако основное ограничение в данном случае будет представлено высоким объемом расходных материалов (биологических рецепторных элементов) и необходимостью создания собственной аппаратуры и оборудования, которые могут обеспечить экологическую и технологическую безопасность страны.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Разработанные в ходе выполнения проекта анализаторы нового поколения могут использоваться для выполнения ежедневных текущих анализов проб воды на предприятиях системы водоочистки РФ, Станциями санитарно-эпидемиологического контроля, службами МЧС, МинПрироды, экологическими структурами и биотехнологическими предприятиями.
Широкомасштабное использование разрабатываемого анализатора приведет к существенному сокращению времени химического анализа сточных, природных и поверхностных вод, что в свою очередь повысит экономическую эффективность служб и организаций занимающихся контролем со-стояния водных ресурсов. Использование современного физико-химического метода анализа вместо морально устаревшего классического химического метода анализа БПК позволит повысить уровень автоматизации анализа, в том числе путем встраивания разрабатываемых анализаторов в состав технологического оборудования для контроля качества сточных вод очистных сооружений на предприятиях. Последнее, в свою очередь, избавит от необходимости постоянного отбора проб и даст воз-можность проводить «он-лайн» мониторинг.
В России аналогичные анализаторы в настоящее время промышленно не выпускаются. Стоимость БПК-биосенсоров зарубежного производства на порядок превышает стоимость анализа-торов, предлагаемых в проекте. Еще одним конкурентным преимуществом разрабатываемого аналитического оборудования является сложность регулярного приобретения расходных материалов (биорецепторов) для закупленного оборудования за рубежом. Разработка собственной технологии РФ и производство аналитической аппаратуры данного класса представляется намного более предпочти-тельным и диктуется в том числе соображениями экологической и технологической безопасности страны.
Долгосрочный социально-экономический эффект от применения разрабатываемой продукции будет заключаться в улучшении экологической ситуации в стране. Использование простого и надежного экспресс-метода контроля содержания загрязняющих органических веществ в воде позволит быстро определять экологически-опасные ситуации реагировать на них.

Текущие результаты проекта:
В ходе выполнения проекта проведен аналитический обзор информационных источников. Как следует из представленных в обзоре данных, биосенсорная детекция БПК является достаточно раз-витым направлением аналитической биотехнологии. Биосенсорные анализаторы БПК представляют собой надежные аналитические инструменты и с успехом используются для контроля водных экосистем наряду с традиционными методами определения БПК. Однако, следует отметить, что несмотря на полученные зарубежными исследователями положительные результаты, поиск новых решений, обеспечивающих более выcокую точность оценки индекса БПК, оперативность и воспроизводимость анализа, продолжаются. Актуальным направлением применения биосенсоров является анализ интегральных характеристик водных сред. В Российской Федерации отсутствует опыт промышленного выпуска анализаторов этого типа, а исследования по данной проблеме начали проводиться сравнительно недавно и не продемонстрировали существенных успехов. Таким образом, актуальным представляется проведение комплекса научно-технических исследований, направленных на разработку экспериментального образца амперометрического биосенсорного анализатора для экспресс-определения биохимического потребления кислорода.
Произведен выбор эффективных биокатализаторов из широкого набора микроорганизмов (родов Pichia, Candida, Debaryomyces, Arxula, Saccharomyces и Gluconobacter) по спектру окисляемых субстратов. Оценка субстратной специфичности клеток Pichia angusta, Candida baidini, Candida maltosa, Candida blankii, Debaryamyces hansenii, Arxula adeninovorans, Saccharomyces pasterianus и Gluconobacter oxydans была проведена по 18 различным субстратам. В качестве субстратов были выбраны легко окисляемые органические вещества, наиболее часто встречающиеся в стоках различных производств. Выявлено, что сенсор на основе иммобилизованных микроорганизмов Debaryamyces hansenii BKM Y-2482 способен окислять все исследуемые органические соединения. Ценным с практической точки зрения является факт наличия ответов на ДДС натрия и ДДБС натрия (компонент моющих средств), а также отсутствие токсического действия данных субстратов на клетки в составе биорецептора. Сенсор на основе дрожжей Arxula adeninovorans BKM Y-2677 наиболее активен по отношению к спиртам с неразветвленной углеродной цепью и глюкозе; наименее предпочтительными для него субстратами из числа протестированных являются аминокислоты и ПАВ. Остальные исследуемые микроорганизмы окисляют более узкий спектр субстратов и менее перспективны для ис-пользования в БПК-биосенсоре.
Произведен выбор эффективных биокатализаторов из широкого набора микроорганизмов по устойчивости при иммобилизации на электроде. Характеристикой устойчивости микроорганизмов при иммобилизации является долговременная стабильность, которая характеризует устойчивость работы сенсора в течение длительного периода времени. Показано, что лучшей долговременной стабильностью обладает биосенсор на основе микроорганизмов Debaryamyces hansenii BKM Y-2482 (42 суток). Дрожжевые микроорганизмы Pichia angusta, Arxula adeninovorans и Saccharomyces pasterianus так же показывают удовлетворительные результаты по стабильности (26, 32 и 23 суток соответственно) и могут быть эффективно использованы для разработки БПК-биосенсора.
Произведен выбор эффективных биокатализаторов из широкого набора микроорганизмов по стабильности при хранении. Из представленных данных следует что все три используемых штамма дрожжей Debaryomyces hansenii сохраняют свою активность в течении времени эксперимента. Активность дрожжей Arxula adeninovorans и Pichia angusta резко меняется в первые 10 дней после выращивания. В последующие 30 дней активность остается практически на постоянном уровне. Таким образом, для обеспечения стабильности рецепторного элемента данные дрожжи необходимо использовать после 10 суток хранения. Активность дрожжей Saccharomyces pasterianus и Candida baidini снижалась на протяжении всего времени эксперимента, что затрудняет их дальнейшее использование. Активность бактерий Gluconobacter oxydans резко изменяется в первые 15 суток, однако в дальнейшем остается стабильной.
Произведен выбор эффективных биокатализаторов из широкого набора микроорганизмов по стабильности при работе. Показано, что лучшей операционной стабильностью обладает рецепторный элемент на основе микроорганизмов Gluconobacter oxydans (2,4%), Arxula adeninovorans (3,3%) и Debaryamyces hansenii Y-2482 (3,2%). Таким образом, по совокупности исследованных характеристик для дальнейшей работы по разработке и подготовка промышленного выпуска амперометрического биосенсорного анализатора для экспресс-определения биохимического потребления кислорода были отобраны микроорганизмы Debaryamyces hansenii ВКМ Y-2482, Arxula adeninovorans ВКМ Y-2677 и Gluconobacter oxydans ВКМ B-1280.
Произведена разработка структурной схемы прибора, определение назначения и основных технических характеристик отдельных узлов объекта разработки. Составлена общая структурная схема анализатора, выделены основные узлы и их характеристики. Рассмотрены возможные режимы работы датчика кислорода и выработаны рекомендации по изготовлению его для работы в режиме измерения концентрации, а не парциального давления кислорода. Рассмотрена возможность сокращения потребления кислорода при измерении за счёт импульсного режима включения датчика, а так-же предложено использование микро– и ультрамикроэлектродов для реализации этой функции.
Произведена разработка согласованных между Исполнителем и Индустриальным партнером основных технических требований к объекту разработки с учетом технологических возможностей ИП. В соответствии со структурной схемой анализатора определена компоновка узлов, сформулированы основные технические требования к ним. Составлена схема амперометрического датчика Кларка с закрепляемым биосенсором, работающего в режиме измерения концентрации кислорода и технические требования к нему.
Произведено изучение возможности использования скрин-принт электродов для определения БПК. В качестве модельных микроорганизмов были использованы уксуснокислые бактерии Gluconobacter oxydans sbsp. industrius B-1280, которые обладают уникальной организацией метаболической системы, характеризующейся поверхностной локализацией ряда основных окислительных ферментов и высокой оперативностью электрон-транспортной цепи, что обеспечивает быстрый ответ биосенсора. В качестве медиаторов электронного транспорта был выбран ферроцен, так как в окислительно-восстановительных системах электронный обмен между окисленной и востановленной формами этого соединения протекает очень быстро. Полученные модифицированные печатные электроды позволяют проводить определение БПК в диапазоне 11 – 180 мг O2/л. Для апробации печатных электродов, модифицированных бактериями G. oxydans и медиатором ферроценом были использованы бродильные массы, отобранные на разных стадиях процессах брожения, имитирующие состав сточных вод биотехнологических производств. Полученные значения совпадают со значениями, полученными референтным методом.
Определены параметры роста штаммов выбранных микроорганизмов и выявлено влияния условий окружающей среды (pH, ионная сила, ионы тяжелых металлов) на окислительную способность этих микроорганизмов. Показано, что удельная скорость роста выбранных микроорганизмов близка. Наибольшей устойчивостью к негативному влиянию ионов тяжелых металлов из всех анализируемых микроорганизмов обладают дрожжи Debaryomyces hansenii. Показано, что максимальный ответ биосенсора на основе бактерий G. oxydans наблюдается в интервале рН 6,0-6,6, на основе дрожжей A. adeninivorans - рН 6,6-7,2, на основе дрожжей D. hansenii рН 6,8-7,2. Выбранные значения рН приемлемы для анализа реальных образцов воды. Наибольшей устойчивостью к влиянию ионной силы раствора обладают дрожжи Debaryomyces hansenii и Arxula adeninivorans, поскольку способны окислять субстрат при солености среды до 20%. Окислительная способность бактерий Gluconobacter oxydans снижается на 90% уже при солености среды порядка 7%.
В ходе выполнения второго отчетного этапа проекта произведена разработка стабильных и воспроизводимых биорецепторных элементов биосенсоров на основе различных способов иммобилизации целых клеток микроорганизмов (включение в химически модифицированный поливиниловый спирт, хитозан, кремнийорганические золь-гель матрицы и капсулирование в диализную мембрану).
Произведено сравнение различных методов иммобилизации микроорганизмов на электроде. Анализируя полученные данные можно сделать вывод о том, что для дальнейшей работы целесообразно применять иммобилизацию дрожжей Debaryomyces hansenii в гидрогель поливинилового спирта модифицированного N-винилпирролидоном. Данный способ иммобилизации позволяет получать стабильные во времени рецепторные элементы с высокой чувствительностью, превосходящей все другие способы иммобилизации в разы. Помимо этого, разработанный рецепторный элемент с содержанием дрожжей 20 мг на 100 мкл гидрогеля модифицированного поливинилового спирта превосходит мировые аналоги по экспрессности, долговременной стабильности и нижней границе определяемых концентраций.
Определены характеристики биокатализаторов на основе целых клеток микроорганизмов по их субстратной специфичности для использования в качестве основы рецепторного элемента биосенсора. Показано, что клетки Debaryomyces hansenii, иммобилизованные всеми использованными методами, способны окислять широкий круг субстратов, которые могут быть обнаружены в сточных водах, что является перспективными с точки зрения возможности их использования для оценки БПК. Иммобилизация в кремнийорганиескую золь-гель матрицу незначительно меняет профиль субстратной специфичности. По-видимому, это связано с затрудненной диффузией субстрата через поры образующейся капсулы, поскольку каждая дрожжевая клетка покрыта кремниевой оболочкой. Свойства полимерных матриц на основе хитозана и химически модифицированного поливинилового спирта не оказывают существенного влияния на профиль субстратной специфичности дрожжей.
Произведено уточнение конструкции кислородного электрода, разработка конструкторской документации. С помощью средств трёхмерного моделирования выявлены основные проблемные узлы конструкции кислородного электрода. Рассмотрены различные варианты конструкции фикса-тора биосенсорного элемента, выявлен наиболее перспективный из них, и создана соответствующая конструкторская документация.
Изучена возможность улучшения эксплуатационных свойств полимерной матрицы на основе химически модифицированного поливинилового спирта для иммобилизации микроорганизмов путем воздействия УФ-облучения. Показано, что УФ-облучение исходного полимера, полученного модификацией ПВС N-винилпирролидоном, значительно увеличивает долговременную стабильность рецепторных элементов, не оказывая существенного влияния на другие параметры.
Произведена подготовка к изготовлению экспериментального образца биосенсорного анализатора БПК. Создана блок-схема работы анализатора в режиме измерения экспресс БПК с биосенсорным элементом. Она реализована в виде специализированной прошивки (подпрограммы) измерительного преобразователя. Подобран корпус и другие части анализатора, определены базовые элементы схемы ИП, удовлетворяющие основным техническим требованиям к объекту разработки. Закуплены необходимые комплектующие и материалы для изготовления инженерного и экспериментального образца. Изготовлен макет датчика оптимальной конструкции для оценки её приемлемости, выявления и устранения недостатков.
Разработана методики создания стабильных и воспроизводимых по свойствам рецепторных элементов биосенсора и методика контроля характеристик рецепторных элементов биосенсора.
Разработана методика иммобилизации микроорганизмов включением в гель на основе хитозана для использования в биорецепторном элементе для определения БПК, методика иммобилизации микроорганизмов включением в гель на основе химически модифицированного поливинилового спирта для использования в биорецепторном элементе для определения БПК, методика иммобилизации микроорганизмов включением в бимодальные кремнийорганические золь-гель матрицы для ис-пользования в биорецепторном элементе для определения БПК, конструкторская документация на кислородный электрод.
Разработаны искусственные ассоциации дрожжевых и бактериальных микроорганизмов с широким спектром окисляемых веществ. Произведено определение стабильности во времени разработанных ассоциаций микроорганизмов методом светового микроскопирования и методом Коха.
Изучено влияние способа иммобилизации и факторов окружающей среды (температуры, ионной силы раствора, pH и концентрации тяжелых металлов) на окислительную активность и стабильность разработанной ассоциации.
Изучена возможность использования природных ассоциаций микроорганизмов на основе активного ила для создания рецепторного элемента биосенсора. Произведено исследование видового состава активного ила с целью выделения из него микроорганизмов с необходимыми потребительскими качествами. Изучена возможность упрощения технологии изготовления полимерной матрицы для иммобилизации микроорганизмов на основе модифицированного поливинилового спирта за счет исключения катализатора из состава композиции.
Таким образом, полученные за данный отчетный период результаты полностью соответствуют требования ТЗ. Работы по проекту проводятся в строгом соответствии с утвержденным ПГ. Охраноспособных РИД на данном отчетном этапе не получено.