Регистрация / Вход
Прислать материал

Новые диагностические тест-системы для генетического тестирования частых наследственных заболеваний в Республике Саха (Якутия)

Номер контракта: 14.575.21.0015

Руководитель: Максимова Надежда Романовна

Должность руководителя: Заведующий лабораторией

Докладчик: Кузнецов Артем Александрович, инженер-исследователь

Организация: федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Северо-Восточный федеральный университет имени М.К. Аммосова"
Организация докладчика: федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Северо-Восточный федеральный университет имени М.К. Аммосова"

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
тест-система, днк-диагностика, генетическое тестирование, биочип, наследственные заболевания, республика саха (якутия), якуты, оксид графена

Цель проекта:
1. Задача проекта: Разработка, создание и подготовка к внедрению инновационных тест-систем для генетического тестирования (ДНК-диагностики) носительства заболеваний, позволяющих проводить быструю и экономически эффективную диагностику частых наследственных заболеваний в якутской популяции. 2. Цели проекта: -Разработка тест-системы на основе биочипа для ДНК-диагностики носительства 5 наследственных заболеваний в Республике Саха (Якутия): 3-М синдрома, SOPH синдрома, тирозинемии 1 типа, наследственной энзимопенической метгемоглобинемии I типа, наследственной несиндромальной глухоты 1А типа. -Разработка флуоресцентной тест-системы на основе оксида графена для ДНК-диагностики носительства 3-М синдрома у населения республики Республике Саха (Якутия). -Разработка оптимизированных (в качественном и экономическом плане) и стандартизированных методик проведения ДНК-диагностики носительства наследственных заболеваний с использованием разработанных тест-систем. -Подготовка к внедрению в клиническую практику тест-систем на основе биочипа и на основе оксида графена для ДНК-диагностики носительства наследственных заболеваний в Республике Саха (Якутия).

Основные планируемые результаты проекта:
1. Промежуточные и заключительный отчеты о ПНИ, содержащие:
а) обзор и анализ современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей научно-техническую проблему, исследуемую в рамках ПНИ;
б) принципы и подходы к созданию тест-системы на основе биочипа для ДНК- диагностики носительства 5 наследственных заболеваний в Республике Саха (Якутия): 3-М синдрома, SOPH синдрома, тирозинемии 1 типа, наследственной энзимопенической метгемоглобинемии I типа, наследственной несиндромальной глухоты 1А типа.
в) общие принципы создания флуоресцентных тест-систем на основе оксида графена, пригодных для лабораторной ДНК-диагностики наследственных заболеваний.
г) принципы и подходы к созданию флуоресцентной тест-системы на основе оксида графена, пригодной для лабораторной ДНК-диагностики 3-М синдрома в Республике Саха (Якутия).
д) обобщение, оценка результативности ПНИ и эффективности результатов в сравнении научно-техническим уровнем.
е) рекомендации к внедрению созданных тест-систем в клиническую практику.
2. Экспериментальные образцы тест-системы на основе биочипа, пригодные для ДНК-диагностики носительства 5 вышеперечисленных наследственных заболеваний в Республике Саха (Якутия).
3. Экспериментальные образцы флуоресцентной тест-системы на основе оксида графена в виде специфического набора биохимических реактивов, пригодная для ДНК-диагностики носительства 3-М синдрома у населения Республики Саха (Якутия).
4. Методики проведения ДНК-диагностики с использованием разработанных тест-систем.
5. Лабораторный технологический регламент синтеза оксида графена.
6. Проект Технического задания на ОКР по теме «Разработка опытного образца тест-системы на основе биочипа для ДНК- диагностики носительства 5 наследственных заболеваний в Республике Саха (Якутия): 3-М синдрома, SOPH синдрома, тирозинемии 1 типа, наследственной энзимопенической метгемоглобинемии I типа, наследственной несиндромальной глухоты 1А типа»
7. Проект Технического задания на ОКР по теме «Разработка опытного образца флуоресцентной тест-системы на основе оксида графена, пригодных для лабораторной ДНК-диагностики 3-М синдрома в Республике Саха (Якутия)».
II. Основные характеристики планируемых результатов (в целом и/или отдельных элементов), научной (научно-технической, инновационной) продукции:
Тест-система на основе оксида графена предназначена для ДНК-диагностики носительства 3М-синдрома у населения РС(Я). Создаваемые экспериментальные образцы тест-системы на основе оксида графена являются аналогом современных широко распространенных флуоресцентных методов ДНК-диагностики (ПЦР в реальном времени, ПЦР с регистрацией сигнала по конечной точке). Суть разработанной тест-системы заключается в использовании оксида графена в качестве наноструктурного тушителя флуоресценции взамен молекулярных тушителей на стадии ДНК-диагностики. Это позволяет существенно сократить себестоимость проведения ДНК-диагностики (до 14 раз) при сохранении высокого качества ДНК-диагностики.
Тест-система на основе биочипа предназначена для ДНК-диагностики носительства 5 наследственных заболеваний у населения РС(Я) Республике Саха (Якутия): 3-М синдрома, SOPH синдрома, тирозинемии 1 типа, наследственной энзимопенической метгемоглобинемии I типа, наследственной несиндромальной глухоты 1А типа. Создаваемые экспериментальные образцы тест-системы на основе биочипа являются уникальной разработкой для России и особенно – республики Саха (Якутия), так как позволяют проводить ДНК-диагностику мутаций, вызывающих 5 частых наследственных заболеваний у якутов (1 человека за раз). Это позволяет существенно сократить стоимость проведения ДНК-диагностики 1 мутации (до 4 раз) и увеличить экспрессность проведения ДНК-диагностики (до 4 раз).

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
1. Конечный продукт ПНИ представляет собой разработанные и испытанные экспериментальные образцы тест-систем на основе биочипа и на основе оксида графена, пригодные для ДНК-диагностики частых наследственных заболеваний у населения РС(Я). Тест-система на основе оксида графена должна позволять проводить ДНК-диагностику носительства мутации, вызывающей одно из самых частых наследственных заболеваний у населения РС(Я). Создаваемые тест-системы с применением оксида графена будут основаны на принципе использования оксида графена в виде наноструктурного тушителя флуоресценции – как замены существующим молекулярным тушителям со сложной структурой и высокой стоимостью производства (в методах, основанных на проведении ПЦР в реальном времени). Это позволит по предварительным оценкам снизить себестоимость проведения одного анализа (по сравнению с классическими методиками ПЦР в реальном времени) и снизить ресурсозатратность на проведение ПЦР, что приведет к быстрым темпам экономического роста проекта после внедрения данных тест-систем в область практического здравоохранения.
Тест-системы на основе биочипов планируется производить для ДНК-диагностики носительства 5 самых частых наследственных заболеваний у якутов (у 1 пациента одновременно). За счет применения инновационных подходов, вероятность появления ложных результатов будет практически полностью исключена, что сделает высоким качество проведения анализов и повысит их надежность.
Запланированная Индустриальным Партнером стоимость проведения анализов с использованием тест-системы на основе 1 биочипа будет в 4 раза дешевле, чем аналогичная стоимость классических методов анализа (ПЦР-ПДРФ, ПЦР в реальном времени), применяемых в практике здравоохранения РС(Я). Экспрессность проведения ДНК-диагностики повысится минимум в 4 раза.
Поэтому, так как разрабатываемые тест-системы будут более экономически эффективны, а также менее время- и ресурсозатратны, чем стандартные методы ДНК-диагностики наследственных заболеваний применяемые в Республике Саха (Якутия), их внедрение в список методов ООО "Генодиагностика" является актуальной задачей с точки зрения повышения качества и экономической рентабельности, а также расширения спектра предоставляемых медицинских услуг.
В целом, внедрение результатов проекта в область практического здравоохранения позволит снизить генетический груз населения РС(Я).
2. Разработанная тест-система на основе оксида графена является уникальной в своем роде ввиду отсутствия в мире подобных тест-систем (на основе оксида графена), пригодных для проведения лабораторной ДНК-диагностики наследственных заболеваний. В ходе разработки данной тест-системы впервые была проведена оптимизация методики синтеза оксида графена для применения в ДНК-диагностике с использованием данной тест-системы. Разработанная тест-система позволяет проводить ДНК-диагностику носительства мутации, вызывающей 3М-синдром у якутов, что является высоко актуальным для медицинской генетики в РС(Я), так как в настоящее время ДНК-диагностика 3М-синдрома у якутов проводиться с помощью намного менее эффективного метода ПЦР-ПДРФ.
Тест-система на основе биочипа также является уникальной в мире, и самой актуальной (в качественном и экономическом плане) для применения в медико-генетическом тестировании населения Республики Саха (Якутия). Подобной тест-системы в мире пока никем не было создано.
Уникальность и новизна созданной тест-системы заключается в возможности проведения с ее помощью ДНК-диагностики 5 частых наследственных заболеваний у якутов. Одновременная ДНК-диагностика 5 частых наследственных заболеваний на 1 биочипе у 1 человека за 1 раз открывает возможности к проведению массового скрининга населения РС(Я) на данные заболевания, чего ранее было невозможно осуществить из-за высокой стоимости проведения ДНК-диагностики стандартными методами (ПЦР-ПДРФ, ПЦР в реальном времени).
Это позволяет в результате создания и проведения испытаний тест-систем подать заявки на оформление двух патентов по вышеуказанным характеристикам тест-систем.
3. Полученные результаты ПНИ находятся близко по уровню к результатам аналогичных работ, приводящихся в мире. В настоящее время во всем мире активно разрабатываются и внедряются биочипы для проведения ДНК-диагностики носительства частых наследственных заболеваний. Например, группа компаний Алкор Био в России в 2005-2010 годах разработала и внедрила биочип для ДНК-диагностики муковисцидоза у населения России. Крупные зарубежные компании (Illumina, Agilent) производят биочипы для проведения ДНК-диагностики тысяч мутаций, определяющих предрасположенность человека к различным заболеваниям. В то же время для повсеместного перехода к самым эффективным биочиповым технологиям необходимо разрабатывать альтернативные методы проведения ДНК-диагностики, более эффективные, чем современные широко распространенные методы ПЦР-ПДРФ и ПЦР в реальном времени, поэтому нами была разработана тест-система на основе оксида графена – более эффективная, чем современные распространенные методы рутинной ДНК-диагностики. Работы ряда зарубежных ученых в последние 2-3 года активно двигались в направлении разработки подобных тест-систем, однако сообщений об их разработке опубликовано не было.
4. Для разработки вышеописанных тест-систем требуется отработка создаваемых методик и процедур проведения анализа на образцах ДНК пациентов с подтвержденным диагнозом по диагностируемым заболеваниям. Поэтому, Индустриальным Партнером - ООО "Генодиагностика" (по внебюджетной линии) были заключены договора с врачами на осмотр пациентов для набора групп пациентов и их родственников с исследуемыми наследственными заболеваниями и контрольной группы людей без наследственных заболеваний. Выделение ДНК пациентов, необходимых для проведения ПНИ, а также контрольное подтверждение диагнозов у больных пациентов проводилось за счет внебюджетных средств Индустриального Партнера с использованием коммерческих тест-систем (TaqMan, Lyteсh) методами ПЦР в реальном времени и ПЦР-ПДРФ.
Под созданием тест-системы на основе биочипов понимается разработка конструкторской схемы биочипа (который представляет собой стеклянный слайд с нанесенными на него генетическими маркерами-олигонуклеотидами), заказ на производство биочипов по разработанной проектной документации отдан соисполнителю – ООО «Вега» ввиду того, что исполнитель не располагает собственным оборудованием для печати биочипов.
В рамках вышеупомянутой цели произведен выбор генетических маркеров и способа их закрепления на поверхности биочипов. Выбор маркеров основан на данных, полученных ранее Исполнителем, в области исследований упомянутых наследственных заболеваний. Произведен дизайн праймеров, необходимых для выделения областей генов ДНК, ответственных за возникновение заболевания.
С учетом опыта работы Исполнителя с биочипами в рамках НИОКР по предыдущим проектам, разработаны и оптимизированы методики проведения анализа с использованием тест-систем на основе биочипов.
В целом, под созданием флуоресцентной тест-системы, понимается разработка специфического набора биохимических реактивов, а также оптимизированной и стандартизованной методики проведения лабораторного ДНК анализа, адаптированной под классическую приборную базу генетических лабораторий.
На текущий момент в мире уже существует небольшой задел в области создания первых прототипов тест-систем на основе оксида графена для ДНК-диагностики, нами впервые удалось разработать пути их адаптации непосредственно под практическую ДНК диагностику носительства заболеваний у человека, то есть в итоге - разработать тест-систему, пригодную к внедрению в клиническую практику.
Для этого был решен ряд проблем, связанных с особенностями строения человеческой (нативной) ДНК и особенностями протекания полимеразных цепных реакций. При современном уровне развития науки, с теоретической точки зрения, данные проблемы не представляли особой сложности. Однако, стоит сказать, что использование оксида графена в качестве наноструктурного тушителя флуоресценции в тест-системах для ДНК-диагностики позволяет снизить стоимость создаваемых тест-систем по сравнению с коммерческими, в которых используются молекулярные тушители флуоресценции.
Для создания флуоресцентных тест-систем ДНК диагностики был усовершенствован метод синтеза суспензии оксида графена для соответствия требованиям тест-систем для ДНК-диагностики по таким характеристикам как чистота, адсорбционная способность и коллоидная стабильность суспензии. В качестве подхода для синтеза устойчивых суспензий оксида графена был использован модифицированный метод Хаммерса. Данный метод позволяет эффективно расслаивать графит на оксид-графеновые нанолисты вплоть до однослойного оксида графена.
На конечном этапе работ планируется провести испытания тест-систем на контрольных выборках нативной ДНК больных и здоровых пациентов (предоставляемых Индустриальным Партнером) с использованием результатов контроля по классическим коммерческим тест-системам (на основе методов ПЦР-ПДРФ и ПЦР в реальном времени).
К возможным рискам проекта можно было бы отнести возможные проблемы при создании абсолютно новых подходов к проведению ДНК-диагностики с использованием тест-системы на основе оксида графена, однако данные риски были пройдены на 1 и 2 этапе ввиду того, что разработанные подходы к созданию тест-системы на основе оксида графена удалось успешно воплотить на практике.


Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
1. Основная область применения планируемых результатов - медицина (лабораторная диагностика), а также молекулярная генетика (планируемые к получению результаты могут быть использованы для разработки аналогичных тест-систем для диагностики других частых наследственных заболеваний).
2. Перспективы использования получаемых результатов можно оценить, ориентируясь на их потенциальных потребителей.
К потребителям ожидаемых результатов в первую очередь относится малое инновационное предприятие ООО "Генодиагностика", созданное в 2011 году на базе УНЛ "Геномная медицина", соучредителем которого является СВФУ. Данная компания является Индустриальным партнером в рамках данного проекта. Магистральной идеей данной компании является внедрение передовых медицинских услуг в области медицинской генетики в республике Саха (Якутия) с использованием инновационных технологий диагностики наследственных и наследственно-предрасположенных заболеваний, в том числе на основе биочипов. С учетом вышеперечисленного, а также того, что разрабатываемые в рамках данного проекта тест-системы для проведения ДНК диагностики наследственных заболеваний будут иметь значительные конкурентные преимущества перед стандартными методами ДНК диагностики, в том числе в плане экономической эффективности, для данной компании внедрение новых методов является очень актуальной задачей.
Второй возможный потребитель – Министерство здравоохранения республики Саха (Якутия) в лице медико-генетической консультации Республиканской больницы №1 (МГК НЦМ РС(Я)). В данном учреждении в настоящее время проводится диагностика 20 наследственных заболеваний с использованием классических методов ДНК анализа. Высокая степень рутинности проведения диагностики стандартными методами не позволяет обеспечить большой поток пациентов, не говоря уже о невозможности проведения массового скрининга населения. Разработка новых типов тест-систем, в частности на основе биочипов, значительно снижающих стоимость проведения 1 анализа, позволит говорить о перспективах проведения массового скрининга на гетерозиготное носительство мутаций, приводящим к вышеуказанным наследственным заболеваниям. К текущему моменту у руководства Минздрава республики Саха (Якутия) и зав. УНЛ «Геномная медицина» Максимовой Н.Р. имеется соглашение о заинтересованности внедрения в практику здравоохранения РС(Я) биочиповой диагностики для проведения массового скрининга новорожденных с целью снижения генетического груза в якутской популяции.
Третий возможный круг потребителей – частные клиники и больницы республики Саха (Якутия), занимающиеся ДНК диагностикой заболеваний (преимущественно инфекционных). Так как МГК НЦМ РС(Я) по факту имеет естественные ограничения по пропускной способности для пациентов, сегмент рынка ДНК диагностики наследственных заболеваний будет оставаться частично открытым новых диагностических лабораторий. А с учетом простоты внедрения технологий биочиповой диагностики и диагностики с использованием тест-систем на основе оксида графена, а также с учетом их ценовых преимуществ, данные технологии диагностики будут являться весьма перспективными для применения в частных республиканских клиниках.
3. Результаты научно-прикладных исследований, проводящихся при создании вышеупомянутых тест-систем, станут фундаментальным заделом в области разработки перспективных методов ДНК-диагностики, что позволит использовать данные результаты для создания новых патентоспособных типов тест-систем на основе биочипов и флуоресцентных биосенсорных тест-систем на основе оксида графена, пригодных для ДНК диагностики других часто встречающихся наследственных, мультифакториальных и инфекционных заболеваний, распространенных в различных мировых популяциях. Перспектива их внедрения в область практического здравоохранения на базе индустриального партнера позволит снизить загруженность и повысить эффективность работы медико-генетической службы РС(Я), основным подразделением которого является в данный момент медико-генетическая консультация РБ№1-НЦМ, которая в данный момент несет на себе всю нагрузку ДНК-диагностики населения классическими рутинными методами.
4. Получаемые результаты научно-прикладных исследований в результате их опубликования опубликованные в журналах, индексируемых в WoS или Scopus смогут оказать положительное влияние на развитие и создание подобных тест-систем в других регионах РФ и мира, участие исполнителей ПНИ в конференциях и выставках позволяет широко проводить демонстрацию и популяризацию результатов проводимых исследований, а также популяризацию знаний в области диагностики наследственных заболеваний среди населения.

Текущие результаты проекта:
По итогам реализации 1 этапа ПНИ были получены следующие результаты:
• Разработаны все теоретические аспекты, необходимые для создания тест-систем на основе биочипа и на основе оксида графена.
• Создан научно-технический задел в области разработки тест-систем на основе оксида графена, пригодных для ДНК-диагностики любых наследственных заболеваний
• Путем комплексного изучения физико-химических свойств окисда графена, разработана оптимизированная методика его синтеза для применения в тест-системе.
• Проведена разработка уникальной тест-системы на основе биочипа для ДНК-диагностики 5 наследственных заболеваний у населения РС(Я) Республике Саха (Якутия): 3-М синдрома, SOPH синдрома, тирозинемии 1 типа, наследственной энзимо-пенической метгемоглобинемии I типа, наследственной несиндромальной глухоты 1А типа.
• Разработанные тест-системы готовы к производству и началу оптимизации процедуры проведения ДНК-диагностики на следующем этапе ПНИ
• Исполнители проекта на первом этапе ПНИ приняли участие в трех российских конференциях, двух выставках, одном форуме, одном конгрессе и одном симпозиуме по теме создания тест-систем для ДНК диагностики.
• По результатам ПНИ была подана в печать 1 статья в Якутский Медицинский Журнал
Полученные результаты соответствуют заявленным требованиям Технического Задания и Плана-графика работ 1 этапа ПНИ.

По итогам реализации 2 этапа ПНИ были получены следующие результаты:
• Проведена разработка методики контроля качества и лабораторного технологического регламента синтеза оксида графена для применения в тест-системах для ДНК-диагностики.
• Синтезировано несколько образцов суспензии оксида графена, успешно прошедших процедуру контроля качества.
• Разработан 3-й вариант тест-системы на основе оксида графена взамен первым двум вариантам, разработанным на 1 этапе ПНИ и признанным негодными для создания экспериментальных образцов тест-системы.
• Разработана эскизная конструкторская документация для тест-систем на основе оксида графена и на основе биочипа, разработаны технологические инструкции по созданию экспериментальных образцов тест-систем.
• Созданы первые работоспособные экспериментальные образцы тест-систем на основе оксида графена и на основе биочипа для проведения ДНК-диагностики частых наследственных заболеваний у населения РС(Я).
• Проведена разработка и успешные испытания методик проведения ДНК-диагностики частых наследственных заболеваний у населения РС(Я) с использованием созданных экспериментальных образцов тест-систем.
• По итогам испытаний установлено, что экспериментальные образцы тест-систем на основе оксида графена и на основе биочипа позволяют проводить достоверную ДНК-диагностику частых наследственных заболеваний у населения РС(Я).
• Проведена оптимизация методик ДНК-диагностики частых наследственных заболеваний у населения РС(Я) с использованием созданных экспериментальных образцов тест-систем. В результате оптимизации была существенно повышена достоверность проведения ДНК-диагностики с использованием разработанных тест-систем.
• Создаваемые экспериментальные образцы тест-системы готовы к проведению испытаний процедуры ДНК-диагностики в реальных лабораторных условиях на следующем этапе ПНИ
• Исполнители проекта на первом этапе ПНИ приняли участие в 2 конференциях и 1 выставке по популяризации результатов ПНИ.

По результатам начала выполнения 3 этапа ПНИ получены следующие результаты:

• Разработан план проведения комплексного физико- химического сравнения оксида графена с аналогичной продукцией зарубежных фирм.
• Разработана программа и методики проведения испытаний созданных тест- систем на основе оксида графена в условиях реальной лабораторной ДНК- диагностики.
• Разрабатывается программа и методика испытаний для тест-системы на основе биочипа. Написана и подана на рассмотрение в журнал «Acta Naturae» (индексируемый в БД Scopus) статья на тему «Подход для диагностики точечных мутаций в нативной ДНК с применением оксида графена».
• Исполнителями ПНИ принято участие в 4 конференциях и 1 выставке по теме проводимых исследований.
• Начато проведение патентных исследований, к текущему моменту не найдено правоохранных документов, мешающих патентованию результатов ПНИ.
• Подана заявка на патент на тему «Способ диагностики точечных мутаций в нативной ДНК с применением оксида графена»
• Проведена контрольная ДНК-диагностика исследуемых наследственных заболеваний в образцах ДНК (200 человек популяционной и контрольной выборки)
• Принята в печать в журнале «Korean Journal of Materials Research» (индексируемом в БД Scopus) статья на тему «Characterization of Graphene Oxide Suspension for Fluorescence Quenching in DNA-Diagnostics».
• Написана и подана на рассмотрение в журнал «Генетика» (индексируемый в БД Scopus) статья на тему «Популяционная частота и возраст мутации G5741→A в гене NBAS, являющегося причиной SOPH-синдрома в Республике Саха (Якутия)», написанная по результатам выполнения ПНИ.