Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка тест-системы на основе технологии секвенирования следующего поколения для молекулярной диагностики митохондриальных патологий.

Номер контракта: 14.575.21.0016

Руководитель: Мазунин Илья Олегович

Должность: Заведующий лабораторией молекулярно-генетических технологий Химико-биологический институт БФУ им. И. Канта

Организация: федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Балтийский федеральный университет имени Иммануила Канта"
Организация докладчика: федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Балтийский федеральный университет имени Иммануила Канта"

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
митохондриальные заболевания, мутации мтднк, пиросеквенирование, молекулярная диагностика

Цель проекта:
Цель проекта - разработать методы молекулярной диагностики митохондриальных болезней. На основе данных о динамике изменения количества мутантных вариантов митохондриальной ДНК разработать модель прогноза течения митохондриального заболевания. Задачи: 1. Разработать структуру базы данных мутаций митохондриальных ДНК и ассоциированных с ними заболеваний. 2. Разработать основанный на пиросеквенировании метод определения абсолютного количества митохондриальных ДНК для четырех основных мутаций (m.11778G>A, m.8993T>G, m.3243A>G, m.8344A>G). 3. Сравнить разработанный метод с другими методами оценки мутантных вариантов (такими как полимеразная цепная реакция в реальном времени, анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов, капиллярное секвенирование по Сенгеру). 4. Разработать алгоритм прогнозирования течения митохондриального заболевания на основе данных по динамике изменения абсолютного количества мутантных митохондриальных ДНК.

Основные планируемые результаты проекта:
Тест-система на основе технологии пиросеквенирования для молекулярной диагностики митохондриальных патологий включает в себя четыре системы олигонуклеотидов состоящих из праймеров прямого и обратного меченного биотином, а так же секвенирующего праймера, четыре системы смесей плазмид содержащих вставки последовательностей мтДНК соответствующих нормальной и мутантоной последовательности по локусам m.11778G>A, m.8993T>G, m.3243A>G, m.8344A>G в соотношениях от 0 до 100% каждой из плазмид с шагом в 10% и от 10 до 1% с шагом в 1%в виде веществ. Отличающееся высокой точностью выявления патогенных мутаций митохондриальной ДНК, ассоциированных с наследственными митохондриальными заболеваниями, нуклеотидными последовательностями синтетических олигонуклеотидов, предназначенных для проведения реакции пиросеквенирования, а так же наличием положительных контролей.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
Олигонуклеотидные праймеры для проведения реакции пиросеквенирования представляют собой синтетические олигонуклеотиды, часть из которых модифицирована биотином. Для детекции одной мутации используется три синтетических олигонуклеотида. Разработанная тест-система позволяет детектировать уровень гетероплазмии четырех патогенных мутаций (m.11778G>A, m.8993T>G, m.3243A>G, m.8344A>G), то есть используется двенадцать синтетических олигонуклеотидов, четыре из которых содержат биотин. В качестве положительного контроля эксперимента используются плазмидные векторы, в которые клонирован фрагмент митохондриальной ДНК, содержащий одну из четырех патогенных мутаций. Сопоставление разработанного метода детекции уровня гетероплазмии обозначенных мутаций с другими молекулярно-генетическими методами позволяет сделать вывод о более высокой разрешающей способности метода (выявление патогенной мутации в количестве 1% методом пиросеквенирования против 20% методом ПДРФ анализа).

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Разработанная в ходе выполнения ПНИ тест-система, после валидации и регистрации, будет использована для диагностики нейродегенеративных и нейромычечных заболеваний, связанных с мутациями в геноме митохондрий. В настоящее время никто в России не осуществляет оценку абсолютного количества мутантных митохондриальных ДНК с целью диагностики данного класса заболева-ний и прогноза дальнейшего течения заболевания. Поскольку митохондриальные заболевания поражают любые органы и ткани в любом сочетании и в любом возрасте, пациенты с данным классом заболеваний представлены в любом учреждении здравоохранения Российской Федерации. Диагностика митохондриальных заболеваний может проводиться, как непосредственно на базе таких учреждений, так и в частных лабораториях, специализирующихся на молекулярной диагностике наследственных заболеваний (например, Лаборатория ИНВИТРО).

Текущие результаты проекта:
Результатом выполнения данного этапа проекта стала разработка протокола оценки динамики изменения абсолютного количества мутантных митохондриальных ДНК у пациентов с митохондриальными заболеваниями; были разработаны технические требования и предложения по разработке, производству и эксплуатации продукции с учетом технологических возможностей и особенностей индустриального партнера - организации реального сектора экономики; был подготовлен проект технического задания на проведение ОКР по теме: "Разработка тест-системы на основе реакции пиросеквенирования для молекулярной диагностике митохондриальных патологий". В итоге, в рамках, выполняемых с привлечением внебюджетных средств, работ был разработан подход к диагностике митохондриальных заболеваний, ассоциированных с мутациями в мтДНК. Таким образом, по результатам завершения этапа ПНИ все поставленные задачи были выполнены в полном объёме.