Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка генетического контроля экзоцитоза

Номер контракта: 14.575.21.0036

Руководитель: Касымов Виталий Анварович

Должность: Заведующий Лабораторией Нейробиологии и Медицинской Физики

Организация: федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Балтийский федеральный университет имени Иммануила Канта"
Организация докладчика: федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Балтийский федеральный университет имени Иммануила Канта"

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
астроцит, клеточная технология, нейротрасмиттер, вирусная конструкция, митохондрия, везикула, экзоцитоз

Цель проекта:
Цель проекта * Формулировка задачи/проблемы, на решение которой направлен реализуемый проект. Одной из основных задач нейробиологии является выяснение механизмов, лежащих в основе передачи информации с одной клетки на другую. В настоящее время всеобщее признание получила везикулярная гипотеза освобождения сигнальных молекул, по которой передача информации от одной клетки мозга к другой происходит за счет химического агента - нейро- или глиотрансмиттера, который концентрируется в везикулах и выделяется из них посредством везикулярного транспорта - экзоцитоза. Везикулярный транспорт трасмиттеров является одним из основных механизмов межклеточных коммуникаций и трансдукции сигнала в головном мозге. В основе нейродегенеративных процессов, включая боковой амиотрофический склероз, болезни Альцгеймера и Паркинсона лежит аксональная патология, которая в большинстве случаев опосредуется изменениями трансмиттерного профиля. На сегодняшний день мы имеем ограниченные знания механизмов патогенеза неврологических и метаболических болезней головного мозга, что негативно сказывается на темпах разработок новых методов лечения заболеваний ЦНС. Качественно-количественный дисбаланс нейро- и глиотрансмиттеров оказывает негативное влияние на межнейрональную коммуникацию. Участниками патогенеза всегда являются нейроны и клетки глии, в частности, астроциты. Согласно последним данным, астроциты принимают непосредственное участие в поддержании трансмиттероного и метаболического баланса, необходимого для нормального функционирования нейронов. Таким образом, разработка методик контроля везикулярного транспорта в астроцитах является перспективным направлением для создания нового типа терапии нейродегенеративных заболеваний. Формулировка цели реализуемого проекта. Целью проекта "Разработка генетического контроля экзоцитоза" является создание методик на основе функциональных и/или генетических конструкций для контроля экзоцитоза в астроцитах головного мозга крысы. Данный проект направлен на: (i) исследование функциональных взаимодействий астроглиальных клеток и нейронов в различных регионах головного мозга, в норме и при патологиях; (ii) определение клеток-источников нейротрансмиттеров и сигнальных молекул, принимающих участие в регуляции количества их выброса, в различных участках головного мозга; (iii) создание новых инструментов для точного контроля клеточных функций in vitro и in vivo через активацию или ингибирование внутриклеточных сигнальных путей, с использованием опто- и хемогенетических подходов (модифицированные свето- или хемочувствительные ионные каналы, протонные помпы, альфа и бета адренорецепторы, G-белок связывающие рецепторы q-типа, активируемых специфическими препаратами); и (iv) разработку новых подходов для точного контроля функций головного мозга через генетическую модификацию и регуляцию целевых клеточных популяций. В целом, исследование направлено на разработку новых терапевтических стратегий, направленных на компенсацию утраченных функций головного мозга.

Основные планируемые результаты проекта:
Основные планируемые результаты проекта *
Краткое описание основных результатов (основные практические и экспериментальные результаты, фактические данные, обнаруженные взаимосвязи и закономерности).

В соответствии с требованиями технического задания и плана-графика выполнения ПНИ планируются следующие результаты по ПНИ в целом:
1) Промежуточные и заключительный отчеты о ПНИ.
2) Отчеты о патентных исследованиях.
3) Лабораторный протокол создания генетической конструкции на основе вирусных векторов.
4) Лабораторный протокол создания моделей культуры клеток астроглии головного мозга крыс.
5) Программа и методики испытаний набора реагентов для специфической трансфекции клеток астроглии в культуре клеток in vitro.
6) Лабораторный протокол трансфекции астроглии in vivo.
7) Программа и методики испытаний экспериментальных образцов набора реагентов для специфической трансфекции клеток астроглии с целью таргетного контроля внутриклеточных каскадов in vivo.
8) Экспериментальные образцы набора реагентов для специфической трансфекции клеток астроглии с целью таргетного контроля внутриклеточных каскадов.
9) Лабораторный протокол создания набора реагентов для трансфекции астроглии на основе вирусных векторов.
10) Проект инструкции по применению набора реагентов для специфической трансфекции клеток астроглии с целью таргетного контроля внутриклеточных каскадов.
11) Рекомендации по коммерциализации результатов ПНИ, а также по использованию в дальнейших исследованиях и разработках.

Основные характеристики планируемых результатов (в целом и/или отдельных элементов), научной (научно-технической, инновационной) продукции.

Полученные в ходе реализации проекта культуры клеток астроглии должны характеризоваться высоким процентом выживаемости и чистоты культуры. Генетические конструкции, разработанные для специфической трансфекции клеток астроглии должны отличаться высоким и стабильным уровнем трансфекции и экспрессии репортерного белка.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции *
Описание конечного продукта, создаваемого с использованием результатов, планируемых при выполнении проекта, места и роли проекта и его результатов в решении задачи/проблемы.

В соответствии с целью выполнения ПНИ нами разработан набор для трансфекции клеток астроглии и сконструирован лентивирусный вектор LVV-GFAP-Case12 на основе усовершенствованного лентивирусного шаттл-вектора pTYF-SW-Linker для трансдукции клеток астроглии и экспрессирования в них зеленого Ca2+-чувствительного флуоресцентного белка Case12.

Оценка элементов новизны научных (технологических) решений, применявшихся методик.

В рамках данного проекта разрабатывается система контроля везикулярного транспорта астроцитов для возможного ее применения в коррекции нейродегенеративных заболеваний. Для понимания роли сигнализации между астроцитами, а также между астроцитами и нейронами в функционировании мозга, решающее значение имеет изучение астроцитов in situ, при котором сложная морфология астроцитов и их тесная связь с нейронами остается неизменными. Понимание взаимодействий между нейронами и глией in vivo требует специальных экспериментальных подходов для манипулирования каждым типом клеток независимо, и это представляет собой нетривиальную задачу. Использование генетических конструкций являются новейшим инструментом для управления клеточными процессами и функциями, позволяющим активировать либо ингибировать определенные внутриклеточные сигнальные каскады как in vitro так и in vivo на бодрствующих животных. В рамках настоящего проекта использованы современные новейшие методы синтетической биологии, направленные на создание функциональных генетических конструкций, обеспечивающих системное изменение фенотипа клеток. Эти подходы включают в себя целевой трансгенез и вирусную трансдукцию для гиперэкспрессии или блокирования экспрессии специфического гена в астроцитах.

Сопоставление с результатами аналогичных работ, определяющими мировой уровень.

Научно-технический уровень выполняемых ПНИ соответствует лучшим достижениям в данной области. Поставленные задачи выполнения прикладных научных исследований в целом решены полностью. Полученные в ходе реализации проекта культуры клеток астроглии характеризуются высоким процентом выживаемости и чистоты культуры. Генетические конструкции, разработанные для специфической трансфекции клеток астроглии отличаются высоким и стабильным уровнем трансфекции и экспрессии репортерного белка. Метод вирусной доставки генов в клетки мозга является передовой технологией разрабатываемой и применяемой в передовых научно-исследовательских центрах мира и имеет большой потенциал в терапии многих нейрогенеративных заболеваний. Все требования, указанные в техническом задании, а именно: - основные требования к выполнению ПНИ (Требования к составу научно-технических результатов ПНИ), - технические требования (Требования по назначению научно-технических результатов), - требования к документации - требования к патентным исследованиям и регистрации результатов интеллектуальной деятельности, выполнены и соблюдены в полном объеме. Научно-технический уровень выполняемой НИР соответствует лучшим достижениям в данной области: подобные разработки ведутся в Стендфордском университете под руководством доктора Карла Диссерот и в Университете Бристоля под руководством доктора Каспарова.

Пути и способы достижения заявленных результатов, ограничения и риски.

Способами достижения заявленных результатов являются:
1) Разработка лабораторного протокола создания моделей культур клеток астроглии головного мозга крыс, в том числе получение первичных смешанных культур глиальных клеток крыс и первичных культур астроцитов. Основными ограничениями и рисками на данном этапе являются: выделение строго определенных анатомических структур/регионов мозга (церебральной коры, гиппокампа и ствола мозга), очистка смешанной глиальной культуры от олигодендроцитов и микроглии для получения чистой культуры астроцитов.
2) Разработка программы и методик испытаний набора реагентов для специфической трансфекции клеток астроглии в культуре клеток in vitro, а также in vivo, в том числе сборка лентивирусного вектора LVV-GFAP-Case12 для трансдукции клеток астроглии и экспрессирования в них зеленого Ca2+-чувствительного флуоресцентного белка Case12 и лабораторных протоколов для трансфекции астроцитов астроглии in vitro и in vivo. Основными ограничениями и рисками на данном этапе являются: таргетная трансфекция строго астроцитарных популяций (специфичность трансфекции), которая достигается использованием астроцит-специфичного промотера GFAP (глиальный фибриллярный кислый белок), а также высокий уровень экспрессии Ca2+-чувствительного флуоресцентного белка Case12 в астроцитах как in vitro, так и in vivo, эффективность экспрессии контролируется по интенсивности флуоресценции.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта *

Описание областей применения планируемых результатов (области науки и техники, отрасли промышленности и социальной сферы, в которых могут использоваться результат или планируемая на их основе инновационная продукция).

Результаты, которые планируется получить в рамках заявляемого проекта, в дальнейшем буду использованы для создания нового типа генной терапии заболеваний, вызывающих деградацию нейронов. Особенностью данной технологии, основанной на вирусной трансфекции клеток, является возможность ее не инвазивного применения. При этом оптимальным является применение хемогенетического контроля экспрессии, используя который можно добиться специфичности экспрессии инкорпорированных генов в определенных зонах головного мозга.

Описание практического внедрения планируемых результатов или перспектив их использования.

Полученные результаты будут способствовать развитию соответствующих направлений технологической платформы «Медицина будущего» и национальной инициативы "Нейротехнологии": нейробиологии, клеточной биологии, синтетической биологии, новых систем для терапии на основе молекулярных и клеточных мишеней.

Оценка или прогноз влияния планируемых результатов на развитие научно-технических и технологических направлений, разработку новых технических решений; на изменение структуры производства и потребления товаров и услуг в соответствующих секторах рынка и социальной сферы.

Опто- и хемогенетические подходы обладают огромным потенциалом применения, как в научных исследованиях, так и в медицине, так как индукция или подавление отдельных сигнальных каскадов или их компонентов, осуществляется простым освещением или аппликацией высоко селективной молекулы-лиганда, и, что немаловажно, данное воздействие на клетку является обратимым. Настоящая работа имеет ключевое значение в развитии нейротехнологий и биомедицины будущего и направлена на поиск способов и создание заделов для нового направления клеточной нейробиологии – управления внутриклеточными функциональными системами. Кроме того, планируется, что отдельные элементы разработки могут быть интересны организациям и компаниям, занятым в разработке средств генной терапии заболеваний, так как создаваемая в рамках проекта технология является более «мягкой» по воздействию на организм, по сравнению с существующими методами.

Оценка или прогноз влияния планируемых результатов на развитие исследований в рамках международного сотрудничества, развитие системы демонстрации и популяризации науки, обеспечение развития материально-технической и информационной инфраструктуры.

Полученные результаты могут послужить основой международного сотрудничества с целью изучения роли астроцитов в норме и при патологии, в частности, при изучении нейродегенеративных заболеваний.


Текущие результаты проекта:
Текущие результаты проекта *

В соответствии с требованиями технического задания и календарного плана была проведена следующая работа:
1.Разработан лабораторный протокол создания моделей культуры клеток астроглии головного мозга крыс.
2.Разработана программа и методики испытаний набора реагентов для специфической трансфекции клеток астроглии в культурах астроцитов in vitro.
3.Проведен контроль экспрессии внедренных генетических конструкций в культуре астроцитов in vitro.
4. Разработан лабораторный протокол трансфекции клеток астроглии in vivo.
5. Разработана программа методик испытаний экспериментальных образцов набора реагентов для специфической трансфекции клеток астроглии с целью таргентого контроля внутриклеточных каскадов in vivo.
6. Проведён контроль экспрессии внедрённых генетических конструкций in vivo.
Поставленные на данном этапе задачи решены полностью, и запланированные работы выполнены в полном объеме. Научно-технический уровень выполняемой НИР соответствует лучшим достижениям в данной области.