Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка биомедицинского препарата гемопоэтических стволовых клеток для персонифицированной протеом-основанной терапии опухолей головного мозга

Номер контракта: 14.575.21.0038

Руководитель: Хотимченко Юрий Степанович

Должность: Директор Школы биомедицины

Организация: федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Дальневосточный федеральный университет"
Организация докладчика: федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Дальневосточный федеральный университет"

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
гемопоэтические стволовые клетки, опухолевые стволовые клетки, трансплантация клеток, биомедицинские клеточные препараты, межклеточное взаимодействие, апоптоз, глиальные опухоли, протеомика.

Цель проекта:
1.Проект направлен на решение одной из самых актуальных задач онкологии - создание эффективных способов лечения больных со злокачественными опухолями головного мозга. Медиана выживаемости больных с первичными и метастатическими опухолями головного мозга, при условии выполнения всех существующих терапевтических протоколов включая хирургическую резекцию, облучение и химиотерапию составляет 8-12 месяцев. Крайне низкая эффективность объясняется наличием в составе опухоли стволовых клеток или опухолевых стволовых клеток (ОСК). Лекарств и технологий способных эффективно убивать ОСК в организме больного практически не существует. Целью проекта является создание технологии для направленного таргетного поражения этой мишени. 2. Основной целью и конечным продуктом реализуемого проекта является создание технологии таргетного уничтожения ОСК и подавления активности опухолевых клеток инфильтрирующих паренхиму мозга, недоступных для воздействия классических противоопухолевых химиопрепаратов. При выполнении проекта будет доказана гипотеза и изучены процессы направленной миграции гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) человека к опухолевым клеткам in vitro и in vivo; изучены механизмы противоопухолевого действия ГСК; обоснована возможность управления ключевыми функциями ОК и ОСК; будет проведено сравнительное протеомное картирование и профилирование нейральной стволовой клетки, мультипотентной мезенхимальной стромальной клетки костного мозга и ОСК первичных и метастатических опухолей головного мозга; будет проведен биоинформационный анализ и идентифицированы мембранные акцепторные белки, связанные с основными путями внутриклеточной сигнальной трансдукции сохранившиеся в ходе трансформации нормальной стволовой клетки в опухолевую, и пригодных для таргетного управления ключевыми функциями ОСК; будут идентифицированы основные белки-лиганды необходимые для воздействия на мембранные белки-рецепторы ОСК; будут разработаны методы ремоделирования транскриптомного профиля ГСК человека в отношении продукции требуемых белков - лигандов; в результате проведенных исследований и полученных результатов будет разработана уникальная в мировой практике биомедицинская технология для воздействия на ОСК и ОК больного с учетом персональной особенностей его опухоли, что повысит эффективность лечения и улучшит показатели выживаемости и качества жизни больных с опухолями мозга.

Основные планируемые результаты проекта:
1. в 2015 году разработана лабораторная технология для изучения процессов и изучены процессы направленной миграции стволовых клеток в отношении глиобластомы линии С6 а также глиобластомы линии U87 и U251. Установлено, что важнейшим источником сигналов индуцирующих миграцию нормальных гемопоэтических столовых клеток являются собственно опухолевые клетки. При этом из всех клеток глиобластомы наилучшей способностью привлекать стволовые клетки обладают именно опухолевые стволовые клетки (ОСК). В свою очередь, клетки имеющие общий гистогенетический источник обладают лучшей подвижностью. Например, нейральные стволовые клетки (СК) активнее мезенхимальных СК мигрируют к клеткам глиобластомы (п. 2.1 ПГ).Проведены эксперименты по совместному культивированию опухолевых клеток и ГСК при условии пространственного разделения культур. установлено, что необходимым условием реализации противоопухолевого потенциала ГСК является непосредственное контактное взаимодействие между стволовыми и опухолевыми клетками делающее возможным обмен цитоплазматическим содержимым посредством экзосом. Инкубация опухолевых клеток в среде содержавшей ГСК не приводит к торможению пролиферации и не вызывает апоптоз неопластических клеток (п 2.2 ПГ).Разработаны методы окраски опухолевых клеток и гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) флуорохромными красителями. Изучены in vitro особенности и механизмы взаимодействия ГСК с клетками первичных и метастатических опухолей мозга. Особенностью ГСК является подавление пролиферации клеток глиобластомы линии С6,U 87 и 251 по мере увеличения количества ГСК. при Соотношении опухолевые/стволовые клетки - 1:3 практически прекращается. Способность нативных ГСК подавлять пролиферацию клеток рака легкого (А549) и молочной железы (MCF-7) более выражена в сравнении с клетками глиобластомы. что очевидно объясняется различием в гистогенетическом источнике этих клеток. Одним их механизмов межклеточной коммуникации является обмен цитоплазматическими белками путем образования экзосом (п 2.3 - 4 ПГ).
Изучены процессы направленной миграции ГСКв организме животного опухоленосителя. Установлено,При введении в кровоток экспериментальных животных с глиобластомой основная часть ГСК (58,5±16,4%) мигрирует в полушарие мозга с опухолью, и приникают в опухолевую ткань. Трансплантация ГСК улучшает функциональный статус животных с глиобластомой и увеличивает их выживаемость после терапии темозоломидом. Непосредственно в опухоли ГСК секрeтируют трансформирующий фактор роста 1 - бета (п 2.5-6 ПГ).
Разработаны методы изучения биоинформационной роли СК в неопластическом очаге. Разработаны методы управления ключевыми функциями опухолевых клеток. Доказано, что обработка ГСК фаскаплизином в количестве 0,005 мкм/л позволяет получить культуру клеток с модифицированным сигналом резко усиливающим противоопухолевую эффективность ГСК (п. 2.7-8).Разработаны методы и проведено протеомное картирование, инвентаризация, профилирование и биоинформационный анализ лизатов белков нейральных (CD 133+) стволовых клеток (НСК), выделенных из обонятельной выстилки носа человека, мультипотентных мехенхимальных (CD29+, CD44+, CD73+, CD90+, СD34–) стромальных клеток (ММСК), полученных из костного мозга человека и опухолевых (CD133+) стволовых клеток (ОСК) глиобластомы человека линии U87. Идентифицированы 1664 белка в изученных лизатах стволовых клеток (СК), из которых 1052 белка (63,2%) идентичны в НСК и ОСК и 607 белков (36,47%) подобны в ММСК и ОСК. Остальные белки в ОСК глиобластомы U87 являются онко-специфичными или связанны с процессами канцерогенеза. Для белков, присутствующих во всех трех протеомах, с помощью международных баз данных проведено аннотирование биологических процессов, молекулярных функций, клеточной локализации и сигнальных путей белков. Выявили, что в глиомасферах глиобластомы линии U87 только 10 внутриклеточных путей сиг-нальной трансдукции (ВКПСТ) практически не изменены неопластическим процессом, но толь-ко 2 из них (путь интегринов и путь фокальной адгезии) доступны для регуляторного воздействия на гены-кандидаты в ядре ОСК. Мембранные белки, неизменных канцерогенезом ВКПСТ и гены экспрессирующие белки этих путей в ОСК глиобластомы линии U87 могут рассматриваться в качестве основных целей и мишеней для таргетного воздействия на ОСК.
Изучены молекулярные механизмы действия TGF-β1 на клетки U87 глиабластомы человека. Выявлены внутриклеточные сигнальные пути, ответственные за участие TGF-β в онкогенезе злокачественных глиом, включающие: EMT, ECM-receptor interaction, regulation of actin cytoskeleton, spliceosome, DNA replication, adherens or tight junction, and focal adhesion, и установлены важные закономерности. Обнаружены кандидатные маркеры метастазирования глиабластомы и потенциальные мишени для терапии этого заболевания. Созданы протеомные карты клеток линии МСА-7 рака молочной железы и F-549 рака легкого человека (работы по п.3.1 -3.4 ПГ).
2. В работе использованы самые современные методы исследования. Культивирование клеток проводилось в автоматическом режиме с использованием установок Cell IQ и станции роботизированного культивирования Tape Biosystems. В работе применена уникальная установка мультифотонной лазерной сканирующей микроскопии (Olimpus). исследование клеточных протеомов выполнено с использованием методов высокоэффективной жидкостной хроматографии - масс-спектрометрии на нанопроточном хроматографе Dionex Ultimate 3000 в сочетании с масс-спектрометром LTQ Orbitrap XL (Thermo Scientific). Для обработки масс-спектрометрических данных использовали программу MaxQuant v1.5.2.8 . Биоинформационный анализ выполнен с использование современной рабочей станции. и программ Proteome Discoverer 1.0 (Thermo), Mascot Server 2.3.02 (Matrix Science, Великобритания) Skyline 1.2.0.3303. Большая часть результатов получена впервые в мире.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
1. Конечный продукт представляет собой технологию модификации стволовых клеток человека в направлении продукции ряда белков воздействующих на ключевые сигнальные пути и поражающих определенные мишени в ОСК. Технология позволяющая улучшить показатели выживаемости и качества жизни больных со злокачественными опухолями головного мозга.
2. Для достижения целей проекта используются самые современные методы и оборудование.
3. Создание клеточных систем с модифицированными свойствами - одно из ключевых направлений в лечении заболеваний. Принципиальным конкурентным преимуществом настоящей технологии является использование аутологического клеточного материала и отказ от вирусов и плазмид как основного способа модификации, что позволяет перейти к клиническому применению при отсутствии опасности инсерционного мутагенеза. Кроме того, таргетная модификация протеома стволовых клеток является самым перспективным подходов в создании биоинженерных клеточных систем с противоопухолевыми свойствами.
4. Способами достижения результатов является использование самого современного оборудования, методов и технологий. На текущий момент риски отсутствуют.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
1.Основной областью применения результатов является онкология.
2. По итогам выполнения проекта будет разработана технология, которая получит широкое внедрение в комплексной терапии злокачественных опухолей головного мозга. Создание клеточных биомедицинских препаратов для направленного воздействия на ОСК приведет к повышению эффективности конвенционных методов лечения и существенно продлит жизнь онкологических больных. Проводимая работа уникальная и инновационная.
3. Работа представляет собой принципиально новое направление в науки и предполагает разроботку принципиально новых молекуляро-биологических подходов к терапии первичных и метастатических опухолей с использованием биомедицинских клеточных и постгеномных технологий.
4. Планируемые результаты представляют высокую ценность для продолжения исследований в рамках международного сотрудничества, проект предоставляет уникальную возможность для развития молекулярной и клеточной биологии на Дальнем Востоке России, обеспечивает развитие материально- технической и исследовательской базы и созданию информационной инфраструктуры.

Текущие результаты проекта:
Разработана лабораторная технология для изучения процессов и изучены процессы направленной миграции стволовых клеток в отношении глиобластомы линии С6 а также глиобластомы линии U87 и U251. Установлено, что источником сигналов индуцирующих миграцию нормальных гемопоэтических столовых клеток являются собственно опухолевые клетки. При этом из всех клеток глиобластомы наилучшей способностью привлекать стволовые клетки обладают именно опухолевые стволовые клетки (ОСК). В свою очередь, клетки имеющие общий гистогенетический источник обладают лучшей подвижностью. Например, нейральные стволовые клетки (СК) активнее мезенхимальных СК мигрируют к клеткам глиобластомы .Проведены эксперименты по совместному культивированию опухолевых клеток и ГСК при условии пространственного разделения культур. установлено, что необходимым условием реализации противоопухолевого потенциала ГСК является непосредственное контактное взаимодействие между стволовыми и опухолевыми клетками делающее возможным обмен цитоплазматическим содержимым посредством экзосом. Инкубация опухолевых клеток в среде содержавшей ГСК не приводит к торможению пролиферации и не вызывает апоптоз неопластических клеток .Разработаны методы окраски опухолевых клеток и гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) флуорохромными красителями. Изучены in vitro особенности и механизмы взаимодействия ГСК с клетками первичных и метастатических опухолей мозга. Особенностью ГСК является подавление пролиферации клеток глиобластомы линии С6,U 87 и 251 по мере увеличения количества ГСК. при Соотношении опухолевые/стволовые клетки - 1:3 практически прекращается. Способность нативных ГСК подавлять пролиферацию клеток рака легкого (А549) и молочной железы (MCF-7) более выражена в сравнении с клетками глиобластомы. что очевидно объясняется различием в гистогенетическом источнике этих клеток. Одним их механизмов межклеточной коммуникации является обмен цитоплазматическими белками путем образования экзосом .Изучены процессы направленной миграции ГСКв организме животного опухоленосителя. Установлено,При введении в кровоток экспериментальных животных с глиобластомой основная часть ГСК (58,5±16,4%) мигрирует в полушарие мозга с опухолью, и приникают в опухолевую ткань. Трансплантация ГСК улучшает функциональный статус животных с глиобластомой и увеличивает их выживаемость после терапии темозоломидом. Непосредственно в опухоли ГСК секрeтируют трансформирующий фактор роста 1 - бета..Разработаны методы изучения биоинформационной роли СК в неопластическом очаге. Разработаны методы управления ключевыми функциями опухолевых клеток. Доказано, что обработка ГСК фаскаплизином в количестве 0,005 мкм/л позволяет получить культуру клеток с модифицированным сигналом резко усиливающим противоопухолевую эффективность ГСК .Разработаны методы и проведено протеомное картирование, инвентаризация, профилирование и биоинформационный анализ лизатов белков нейральных (CD 133+) стволовых клеток (НСК), выделенных из обонятельной выстилки носа человека, мультипотентных мехенхимальных (CD29+, CD44+, CD73+, CD90+, СD34–) стромальных клеток (ММСК), полученных из костного мозга человека и опухолевых (CD133+) стволовых клеток (ОСК) глиобластомы человека линии U87. Идентифицированы 1664 белка в изученных лизатах стволовых клеток (СК), из которых 1052 белка (63,2%) идентичны в НСК и ОСК и 607 белков (36,47%) подобны в ММСК и ОСК. Остальные белки в ОСК глиобластомы U87 являются онко-специфичными или связанны с процессами канцерогенеза. Для белков, присутствующих во всех трех протеомах, с помощью международных баз данных проведено аннотирование биологических процессов, молекулярных функций, клеточной локализации и сигнальных путей белков. Выявили, что в глиомасферах глиобластомы линии U87 только 10 внутриклеточных путей сиг-нальной трансдукции (ВКПСТ) практически не изменены неопластическим процессом, но толь-ко 2 из них (путь интегринов и путь фокальной адгезии) доступны для регуляторного воздействия на гены-кандидаты в ядре ОСК. Мембранные белки, неизменных канцерогенезом ВКПСТ и гены экспрессирующие белки этих путей в ОСК глиобластомы линии U87 могут рассматриваться в качестве основных целей и мишеней для таргетного воздействия на ОСК. Изучены молекулярные механизмы действия TGF-β1 на клетки U87 глиабластомы человека. Выявлены внутриклеточные сигнальные пути, ответственные за участие TGF-β в онкогенезе злокачественных глиом, включающие: EMT, ECM-receptor interaction, regulation of actin cytoskeleton, spliceosome, DNA replication, adherens or tight junction, and focal adhesion, и установлены важные закономерности. Обнаружены кандидатные маркеры метастазирования глиабластомы и потенциальные мишени для терапии этого заболевания. Созданы протеомные карты клеток линии МСА-7 рака молочной железы и F-549 рака легкого человека.