Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка молекулярных сигнатур аутоантител к аддуктам ДНК для ранней диагностики рака легкого

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
рак легкого, биомаркер, аддукт днк, аутоантитела, ранняя диагностика, масс-спектрометрия, мультиплексный анализ

Цель проекта:
Проект направлен на решение проблемы ранней диагностики рака легкого путем использования молекулярных циркулирующих опухолеассоциированных маркеров в плазме крови. Для этого перед проектом ставяться следующие цели: - Идентификация методами масс-спектрометрии аддуктов циркулирующей ДНК в образцах клинического материала; - Разработка мультиплексного анализа аутоантител к аддуктам циркулирующей ДНК; - Разработка мультиплексного теста для исследования аутоантител к аддуктам ДНК в сыворотке больных с опухолями легкого. Цель реализации проекта: внедрение новых методов диагностики в сферу оказания специализированной медицинской помощи для увеличения результативности лечения и снижения смертности от онкологических заболеваний

Основные планируемые результаты проекта:
Основным результатом проекта явится список опухолеспецифичных маркеров - иммуногенных аддуктов внеклеточной ДНК, которые при достижении пороговых концентраций приводят в появлению аутоантител. На последних этапах реализации проекта будет разработан макет тест-системы на основе иммуноферментного мультиплексного анализа.
Было выявлено, что ДНК-аддукты могут быть потенциальными маркерами риска возникновения РЛ, их содержание в тканях является результирующей взаимодействия канцерогенных факторов и организма с учетом индивидуальных особенностей функционирования систем метаболизма и репарации. В ходе анализа литературы и проведения собственных исследований был сформирован список аддуктов-потенциальных маркеров:
1. бензапирен-7,8-дион;
2. бензапирен-7,8-диол-9,10-эпоксид;
3. 4-аминобифинил;
4. 1,N2-пропанодезоксогуанозин;
5. N2-этилдезоксогуанозин;
6. 7-этилгуанин;
7. 4-(метилнитрозамино)-1-(3-пиридил)-1-бутанол;
8. O6-метилдезоксогуанозин;
9. O2-[4-(3- пиридил)-4-оксобут-1-ил]-дезокситимидин;
10. N2 метил-дезоксогуанозин;
11. N-(дезоксогуанозин-8-ил)-2-амино-1-метил-6-фенилимидазо[4,5-b]пиридин.
Были разработаны и валидированы масс-спектрометрическая и мультиплексная методики анализа, а также методики пробоподготовки.
Для решения поставленных в проекте задач разработан и утвержден протокол, на основе которого проведено исследование по формированию клинических групп. Сформированы 2 основных группы по 100 человек– больных раком легкого и условно здоровых лиц. У всех обследованных проведен забор биологического материала – плазмы крови. Группы сравнения максимально сопоставимы по полу, возрасту, фактору курения. Для сбора клинического материала проводится многоцентровое клиническое исследование на базе НИИ онкологии и Томского областного онкодиспансера. Для исследователей разработаны стандартные операционные процедуры.
В конечном итоге результатом проекта явится макет тест-системы, обеспечивающий раннюю диагностику рака легкого с чувствительностью не менее 90 % и селективностью не менее 75 %

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
На сегодняшний день даже использование новых методов диагностики, таких как ПЭТ, аутофлюоресцентная бронхоскопия имеют низкую диагностическую значимость на ранних стадиях заболевания. Существующие тест-системы обладают низкой селективностью и специфичностью. Реализация проекта позволит создать принципиально новые селективные и чувствительные тест-системы для ранней диагностики рака легкого, обеспечивающие чувствительность не менее 90% и специфичность не менее 75 %. Диагностика указанного заболевания на ранней стадии позволит:
– снизить смертность населения от злокачественных новообразований, в том числе в течение года с момента взятия на учет;
– увеличить показатели раннего выявления злокачественных новообразований, оптимизировать и стандартизировать систему оказания медико-социальной помощи онкологическим больным;
– увеличить показатели выживаемости и улучшения качества жизни больных со снижением инвалидности.
Данный проект преследует основную цель стратегии развития медицинской науки в Российской Федерации на период до 2025 года – развитие передовых медицинских технологий и внедрение на их основе инновационных продуктов, обеспечивающих сохранение и улучшение здоровья населения.
На основе полученных результатов индустриальным партнером за счет собственных средств будут проведены опытно-конструкторские и опытно-технологические работы, направленные на создание и постановку на производство высокоселективных комплексов для диагностики рака легкого.
На основе разработанного в рамках проекта макета будут произведены тестовые партии продукта, которые будут использованы для проведения клинического исследования и демонстрации эффективности предложенного метода диагностики. Одновременно будут подготовлены и направлены в соответствующие органы документы для регистрации диагностической системы в качестве изделия медицинского назначения.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
На сегодняшний день даже использование новых методов диагностики, таких как ПЭТ, аутофлюоресцентная бронхоскопия имеют низкую диагностическую значимость на ранних стадиях заболевания. Существующие тест-системы обладают низкой селективностью и специфичностью. Реализация проекта позволит создать принципиально новые селективные и чувствительные тест-системы для ранней диагностики рака легкого, обеспечивающие чувствительность не менее 90% и специфичность не менее 75 %.
Конечными потребителями результатов настоящего проекта – тест-систем для диагностики рака легкого, являются диагностические лаборатории (Инвитро, KDL и др.) – более 20 тысяч организаций в РФ, медицинские центры онкологической направленности (ФГБУ "НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова, НИИ Онкологии СО РАМН и т.д., лечебно-профилактические учреждения, имеющие в своем составе онокологичские отделения (более 2000 организаций в России).
Социально-экономический эффект достигается за счет внедрения в практическое здравоохранение тест-систем, обеспечивающих достоверную раннюю диагностику социально-значимого заболевания – рака легкого. Диагностика указанного заболевания на ранней стадии позволит:
– снизить смертность населения от злокачественных новообразований, в том числе в течение года с момента взятия на учет;
– увеличить показатели раннего выявления злокачественных новообразований, оптимизировать и стандартизировать систему оказания медико-социальной помощи онкологическим больным;
– увеличить показатели выживаемости и улучшения качества жизни больных со снижением инвалидности.
Данный проект преследует основную цель стратегии развития медицинской науки в Российской Федерации на период до 2025 года – развитие передовых медицинских технологий и внедрение на их основе инновационных продуктов, обеспечивающих сохранение и улучшение здоровья населения.
Промышленная реализуемость проекта обеспечивается привлечением индустриального партнера, имеющего опыт в организации производства и продаж диагностических тест-систем, и располагающего необходимыми производственными мощностями и ресурсами.

Текущие результаты проекта:
Проведен аналитический обзор научной и технической литературы, определен метод исследования, определен список маркеров. Разработан и утвержден дизайн клинического исследования «случай-контроль». На его основе проведено пилотное исследование и сформированы группы обследуемых: 100 больных раком легкого и 100 условно здоровых лиц. Разработаны стандартные операционные процедуры для сбора и хранения образцов биологического материала, а также для выделения и хранения ДНК. У всех пациентов проведен забор образцов клинического материала - плазмы крови. Составлен компьютерный регистр клинико-патологических и лабораторных данных на пациентов.
Разработаны и валидированы следующие методики: методика пробоподготовки клинического материала для масс-спектрометрического исследования и мультиплексного анализа, методика масс-спектрометрического анализа аддуктов ДНК и методика мультиплексного анализа. Методика пробоподготовки клинического материала для масс-спектрометрического исследования включает в себя выделение ДНК из плазмы крови колоночным методом, расщепление внДНК с помощью кислотного гидролиза и дальнейшую очистку и концентрирование аддуктов ДНК методом твердофазной экстракции. Дальнейший масс-спектрометрический анализ включает этапы разделения компонентов смеси методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в обращено-фазовом режиме и последующее масс-спектрометрическое детектирование в режиме мониторинга множественных реакций. Данные методы были валидированы по следующим параметрам: специфичность; линейность; нижний и верхний пределы количественного определения; повторяемость; промежуточная прецизионность; правильность.
Определены ключевые компоненты макета тест-системы: олигонуклеотиды с аддуктами, баркодированные микрочаситцы, блокирующие реагенты, антитела для выявления человеческих иммуноглобулинов флуоресцентным методом. Отработаны протоколы конъюгации олигонуклеотидов с микрочастицами. В качестве блокирующего реагента выбрана сыворотка крови крупного рогатого скота. Методика пробоподготовки для мультиплексного анализа была отработана на примере аутоантител к карбогидратным группам