Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка экспериментального образца регенерируемого нанопроволочного биосенсора для регистрации маркеров социально-значимых заболеваний в сыворотке крови.

Номер контракта: 14.575.21.0065

Руководитель: Набиев Игорь Руфаилович

Должность: Зав. лабораторией нано-биоинженерии

Организация: федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский ядерный университет "МИФИ"
Организация докладчика: Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Национальный исследовательский ядерный университет "МИФИ"

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
биосенсор, диагностика онкологических заболеваний, биоконъюгаты, онкомаркеры, антигены, ифа, фотонный кристалл, полупроводниковые нанокристаллы, квантовые точки.

Цель проекта:
1. Разработка экспериментального образца регенерируемого нанопроволочного биосенсора для регистрации маркеров социально-значимых заболеваний в сыворотке крови. 2. Создание экспериментального образца регенерируемого нанопроволочного биосенсора для регистрации белковых маркеров социально-значимых заболеваний в сыворотке крови, разрабатываемого на основе метода иммуноферментного анализа (ИФА) «сэндвич»-типа, обеспечивающего: - достижение более высокой (в сравнении с аналогами) аналитической чувствительности экспериментального образца регенерируемого нанопроводного биосенсора. - возможность многократного использования экспериментального образца регенерируемого нанопроводного биосенсора.

Основные планируемые результаты проекта:
1.1 Промежуточные и заключительный отчеты о ПНИ.
1.2 Лабораторный регламент изготовления экспериментальных образцов биосенсоров.
1.3 Проект инструкции по эксплуатации биосенсора для регистрации целевых белков.
1.4 Отчет о патентных исследованиях, оформленный в соответствии с ГОСТ 15.011-96.
1.5 Технические требования и предложения по разработке, производству и эксплуатации
1.6 Методика переведения квантовых точек в водную фазу.
1.7 Методика получения конъюгатов квантовых точек с детекторными антителами.
1.8 Методика подготовки поверхности биосенсора к модификации аффинными молекулами.
1.9 Проект технического задания на проведение ОКР по теме: «Разработка опытного образца регенерируемого биосенсора для детектирования маркеров заболеваний в сыворотке крови».
1.10 Методика регенерации биосенсора для повторного использования.
1.11 Экспериментальные образцы высоколюминесцентных квантовых точкек на основе селенида кадмия.
1.12 Экспериментальные образцы регенерируемого нанопроводного биосенсора.
1.13 Экспериментальные образцы коньюгатов детекторных антител с квантовыми точками.
1.14 Экспериментальный образец корпусного адаптера.

2.1 Экспериментальный образец регенерируемого нанопроводного биосенсора должен представлять собой массив кремниевых нанопроволок на кремниевой подложке, формирующих фотонную структуру, усиливающую излучение меток на основе квантовых точек, для регистрации белковых маркеров рака груди и рака простаты. Антитела к исследуемым маркерам должны быть ковалентно иммобилизованы на поверхности кремниевых нанопроволок.
2.2 Экспериментальный образец регенерируемого нанопроводного биосенсора должен иметь возможность регенерации с помощью регенерирующего раствора после каждого цикла анализа. При этом поверхность экспериментального образца биосенсора с антителами, экспонированными на поверхности нанопроволок, должны регенерироваться до исходного, активного состояния. Молекулы, участвующие в образовании «сэндвича» (маркеры, детекторные антитела с флуоресцентными метками) должны удаляться за счет промывки регенерирующим раствором, разрушающим специфические связи антиген-антитело, но при этом сохраняющим пространственную структуру и активность иммобилизованных на подложке антител.
2.3 Экспериментальный образец регенерируемого нанопроводного биосенсора должен обладать более высокой (в сравнении с аналогами) аналитической чувствительностью:
1) в качестве флуоресцентных меток должны быть использованы полупроводниковые квантовые точки, сигнал флуоресценции которых может значительно превышать таковой для широко используемых органических флуоресцентных меток за счет их значительно более высокой фотостабильности и как следствие возможности применения мощных источников возбуждения и накопления сигнала;
2) сигнал флуоресценции квантовых точек должен усиливаться в фотонной структуре, представляющей собой массив кремниевых нанопроволок, выступающей в качестве подложки для сборки иммуносэндвича.
2.3 Конструкция экспериментального образца регенерируемого нанопроводного биосенсора должна обеспечить возможность его использования со стандартными флуоресцентными ридерами, используемыми в лабораторной клинической практике для проведения ИФА.
2.4 Экспериментальные образцы регенерируемого нанопроводного биосенсора, получаемые в ходе ПНИ, должны обладать следующими техническими характеристиками:
- каждый экспериментальный образец биосенсора должен содержать не менее 2 массивов кремниевых нанопроволок, поверхностно-модифицированных аффинными молекулами;
- латеральный размер отдельной нанопроволоки должен лежать в диапазоне от 50 до 500 нм;
- высота отдельной нанопроволоки должна находиться в диапазоне 100 нм до 1 мкм;
- расстояние между соседними нанопроволоками должно составлять не менее 100 нм;
- дисперсия по размеру нанопроволок в массиве не должна превышать 5%;
- добротность микрорезонатора, сформированного массивом нанопроволок, должна быть не менее 100;
- поверхность аналитической области биосенсора должна быть гидрофилизирована и содержать функциональные группы, пригодные для последующей ковалентной иммобилизации антител;
- иммобилизация антител на поверхность биосенсора должна быть осуществлена под контролем сохранения активности антител;
- не менее 80% аналитической области биосенсора должно быть задействовано в иммобилизации антител;
- соотношение сигнал/шум должно составлять не менее 3 в регистрируемом спектре излучения при детектировании целевых белков с концентрацией 10-15 моль/л;
- должно осуществляться сужение спектра люминесцентного сигнала меток и его усиление не менее чем на 1 порядок, за счет действия фотонной структуры, формируемой массивом нанопроволок;
- должна быть обеспечена возможность одновременной детекции нескольких маркеров в отдельных ячейках биосенсора.
2.5 Инструкция по эксплуатации экспериментального образца регенерируемого нанопроводного биосенсора должна включать методику регистрации белков - маркеров рака молочной железы и рака простаты в образцах сыворотки крови человека.
2.6 Конструкция экспериментального образца корпусного адаптера биосенсора должна соответствовать стандартным планшетам, используемым в стандартных анализах методом ИФА.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
1. Задачей настоящей работы является разработка экспериментального образца регенерируемого нанопроволочного биосенсора для регистрации маркеров социально-значимых заболеваний в сыворотке крови. Разрабатываемый биосенсор будет обладать преимуществами по сравнению с используемыми на данный момент в клинике диагностическими системами:
- превосходить по чувствительности используемые на данный момент диагностические системы;
- иметь компактный формат, который позволит затрачивать меньшие количества биоматериала для проведения анализа;
- используя разработанную методику регенерации, биосенсор можно будет использовать неоднократно;
- конструкция биосенсора будет адаптирована для его использования со стандартными флуоресцентными ридерами, используемыми в лабораторной клинической практике.
2. Все разработанные в рамках проекта методики являются новаторскими и не повторяют результаты других работ. Особенно нетривиальными задачами являются разработанные технологии иммобилизации антител и последующая сборка иммунодиагностического комплекса на поверхности массива нанопроволок, поскольку все манипуляции происходят не на плоской поверхности, а в объеме 2-мерного фотонного кристалла.
3. Наиболее близкие к разрабатываемой в рамках проекта системы, описанные в литературе, основаны на фотонных кристаллах, в которых одновременно происходит усиление сигнала флуоресцентной метки и увеличение эффективности сбора сигнала. В литературе описаны биосенсоры на основе одномерных фотонных кристаллов, позволяющие детектировать антитела, флуоресцентно меченые органическими флуорофорами, а также нуклеиновые кислоты. В ряде работ последних лет было показано увеличение интенсивности флуоресценции и сужение пика эмиссии квантовых точек при их включении в фотонные кристаллы. Однако биосенсоры, основанные на использовании квантовых точек в качестве флуоресцентных меток, введенных в фотонные кристаллы, пока не были представлены ни в литературе, ни в законченных прикладных разработках.
4. Разработка биосенсора проводится в несколько этапов.
4.1 На первом этапе исследования проводится математическое моделирование распределения электромагнитной волны в фотонной структуре и оптимизация параметров планируемой к созданию фотонной структуры для получения максимального сужения и усиления сигнала введенного флюорофора. При этом будут учитываются ограничения, накладываемые необходимостью обеспечения доставки детектируемых белков к иммобилизированным антителам, а также регенерации сенсора путем отмывки. Моделирование проводится методом конечных разностей во временной области (FDTD, Finite Difference Time Domain). В качестве базовой структуры сенсора выбран двумерный фотонный кристалл, сформированный массивом нанопроволок. Предлагаемая схема позволяет добиться высокой добротности резонатора в сочетании с возможностью прямого доступа аналита в объем фотонного кристалла, а также предусматривает возможность его регенерации методами отмывки.
4.2 На втором этапе исследования будет создана подложка биосенсора, представляющая собой упорядоченный массив нанопроволок, формирующих двумерную фотонную структуру. Подложка будет сформирована через металлическую (никелевую) маску при помощи методики реактивного ионного травления (РИТ, RIE). Данный процесс позволяет травить кремниевую пластину анизотропно, в отличие от жидкостного химического травления. Металлическая маска будет сформирована методом электронно-лучевой литографии (ЭЛЛ, EBL), отличающимсявысокой разрешающей способностью, достигающей 10 нм, а также высокой повторяемостью размеров структур, формируемых внутри массива (погрешность составляет порядка 1%). В дальнейшем, поверхность подложки будет подвергнута электрохимическому травлению для придания ей пористости и увеличения площади поверхности сенсора.
4.3 На третьем этапе, аналитическая площадь поверхности сенсора (а именно, поверхность нанопроволок) будет сделана полярной и функционализирована для последующей конъюгации с антителами, способными специфично распознавать онкомаркеры. Процесс модификации поверхности кремниевых нанопроволок будет включать:
- термическое окисление поверхности массива нанопроволок на глубину до 10 нм с целью введения активных силанольных групп Si-(OH)2, пригодных для проведения дальнейшей функционализации;
- силанизацию: модификацию окисленной поверхности массива нанопроволок 3-аминопропилтриэтоксисиланом с целью введения на поверхность нанопроволок функциональных аминогруп ( NH2);
- введение на поверхность нанопроволок карбоксильных групп для последующей ковалентной пришивки распознающих антител, производимое посредством обработки поверхности сенсора ангидридом янтарной кислоты;
- оптимизация условий модификации поверхности с целью достижения максимального числа центров связывания распознающих антител на активной поверхности сенсора.
4.4 На четвертом этапе поверхность нанопроволок будет активирована путем введения бифункциональных сшивающих реагентов. Затем активированная подложка будет приведена в контакт с распознающими антителами, которые необратимо свяжутся с поверхностью подложки посредством образования ковалентных связяй. Способ иммобилизации антител на поверхности нанопроволок, а также условия конъюгации (рН, концентрации реагирующих веществ, время инкубации и др.) будут оптимизированы. Таким образом будет получен биосенсор, пригодный для дальнейшей отработки методики регистрации белковых маркеров рака молочной железы и рака простаты в образцах сывороток крови человека.
4.5 Будут синтезированы высоколюминесцентные квантовые точки на основе селенида кадмия, имеющие квантовый выход (КВ) люминесценции не менее 90% в органической фазе. Далее будет произведена их обработка производными полиэтиленгликоля (ПЭГ), содержащими карбоксильные, гидроксильные, или аминогруппы, а также их смесями с контролируемым процентным содержанием каждого производного ПЭГ, для перевода КТ в водную фазу с сохранением КВ не менее 50%. Очистка суспензий солюбилизированных КТ от избытка ПЭГ будет осуществляться методом гель-проникающей хроматографии. Будет проведен анализ очищенных суспензий методом динамического светорассеяния и измерен ξ-потенциал поверхности солюбилизированных КТ.
4.6 Будет разработана методика получения конъюгатов КТ с детекторными антителами, высокоспецифичными к маркерам рака молочной железы и рака простаты.
4.7 Методика регистрации белков - маркеров рака молочной железы и рака простаты в образцах сывороток крови человека будет включать следующие этапы:
- блокировка биосенсора с иммобилизованными на его поверхности антителами с помощью буферных растворов, содержащих бычий сывороточный альбумин (БСА) или казеин, для предотвращения неспецифического связывания биомолекул и биоконъюгатов с поверхностью биосенсора;
- нанесение в лунки биосенсора образцов сыворотки крови человека и контрольных образцов; инкубация в течение 40-60 минут;
- отмывка биосенсора от анализируемых растворов;
- нанесение растворов конъюгатов КТ с детекторными антителами, специфичными к онкомаркерам; инкубация в течение 40-60 минут;
- отмывка биосенсора от избытка несвязавшихся конъюгатов;
- анализ флуоресценции биосенсора, который будет осуществляться на стандартном оборудовании для анализа флуоресценции в планшете для ИФА;
4.8 Будет отработана методика регенерации биосенсора после проведения анализа. Регенерация будет заключаться в промывке биосенсора специальным регенерирующим раствором, который разрушает специфические связи антиген-антитело, но при этом позволяет сохранить пространственную структуру и активность иммобилизованных на подложке антител.
4.9 Конструкция корпуса биосенсора будет соответствовать стандартным планшетам, используемым в стандартных анализах методом ИФА. За счет уникальных спектральных свойств КТ (одновременное возбуждение флуоресценции нескольких типов меток светом одной длины волны) будет обеспечена возможность одновременной детекции нескольких маркеров в отдельных ячейках биосенсора.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Областью применения ожидаемых результатов является лабораторная клиническая диагностика онкологических заболеваний и, в частности, обнаружение онкозаболевания на ранних стадиях развития, когда патологический очаг невозможно диагностировать другими методами. Онкомаркеры позволяют диагностировать опухоли и обнаружить метастазы за несколько месяцев до их обнаружения инструментальными (рентгенография, компьютерная томография, магнитно-резонансная томография, ультразвуковое исследование), цито- и гистологическими методами. Одновременная диагностика нескольких маркеров (например, маркеров рака молочной железы CEA, CA 15-3, CA 27.29) в формате одного биосенсора позволит провести комплексный анализ и при этом сэкономить биоматериал и уменьшить количество затрачиваемого времени на анализ.

Не менее значимым является контроль содержания онкомаркеров в крови для оценки эффективности терапии, раннего выявления рецидивов и метастаз. Несмотря на то, что на данный момент известно более 200 онкомаркеров, в клинической практике используют только около 20 из них. Ограничение их использования связано с большой вариабельностью результатов в зависимости от конкретного пациента, сложностью трактовки результатов анализа, а также с тонкими отличиями в методах отбора и обработки биологических проб, что может приводить к серьезным систематическим ошибкам. Однако, и сейчас в научных лабораториях ведутся активные поиски новых онкомаркеров, которые могут быть внедрены в клиническую практику, обеспечивая большую чувствительность и надежность проводимых анализов. Принципиальная схема биосенсора, предлагаемая в настоящем проекте, может быть адаптирована для анализа не только онкомаркеров рака молочной железы и рака простаты, но и других видов рака. Кроме того, после замены использумых в разрабатываемом прототипе антител на антитела, специфичные к биомаркерам других социально-значимых заболеваний, создаваемая диагностическая система будет применима для всех видов анализа, в основе которых лежит принцип ИФА.

Возможными потребителями результатов, полученных в ходе выполнения данной ПНИ, являются научные и индустриальные организации, работающие в области создания, исследования свойств и контроля качества широкого класса функционализированных нанокомпозитных материалов и высокоэффективных фотонных структур.
Не мене важными потребителями результатов ПНИ являются организации, занимающиеся биомедицинскими и биологическими исследованиями, в частности Индустриальный партнер проекта компания «Наномультиплекс» - малое динамично развивающееся инновационное предприятие, резидент «Сколково». Деятельность компании направлена на создание и коммерциализацию качественно нового класса инструментов (наборов реагентов и аналитических приборов) для высокоточной и многопараметрической ранней диагностики онкологических, аутоиммунных и инфекционных заболеваний человека с помощью флуоресцентных полупроводниковых нанокристаллов (квантовых точек), которые превосходят существующие аналоги по чувствительности при детекции биомаркеров заболеваний - более чем в 100 раз и по фотостабильности более чем в 1000 раз. Кроме того, компания «Наномультиплекс» существенно расширяет диапазон применения флуоресцентных квантовых точек, разрабатывая подходы к созданию различных нанокомпозитных материалов на основе органических матриц (полиметилметакрилат, полистирол, полисилоксаны, органические полупроводники и полимерно-сшитые жидкокристаллические смеси), допированных флуоресцентными квантовыми точками.
Возможные конечные потребители результатов ПНИ на уровне их внедрения в практику:
- Российский онкологический научный центр им. Блохина РАМН;
- Институт эпидемиологии и микробиологии им. Гамалеи Минздрава РФ.
- ООО Наномультиплекс.
Полученные результаты, опубликованные в открытой печати и представленные на многих международных конференциях окажут влияние на расширение международного сотрудничества, в частности, с Институтом экспериментальной медицины Макса Планка (Геттинген, Германия) и Университетом Марбурга (Германия).



Текущие результаты проекта:
1. Выполнен аналитический обзор научно-технической, методической литературы.
2. Проведены патентные исследования по теме.
3. Определено направление дальнейших исследований для разработки регенерируемого нанопроволочного биосенсора для регистрации маркеров социально-значимых заболеваний.
4. Определены оптимальные параметры массива нанопроволок, формирующего структуру фотонного кристалла.
5. Разработан метод изготовления массива нанопроволок на кремниевой подложке и оптимизированы параметры его изготовления.
6. Изготовлены первые экспериментальные образцы подложек биосенсора, представляющих собой массив нанопроволочных структур, и изучена их морфология.
7. Разработана подложка экспериментального образца биосенсора.
8. Изготовлены высоколюминесцентные квантовые точки CdSe/ZnS, имеющие квантовый выход фотолюминесценции >90% в органической фазе.
9. Разработана методика переведения квантовых точек в водную фазу.
10. Разработан метод подготовки поверхности биосенсора к модификации аффинными молекулами.
11. Разработан способ подачи и забора аналита в зону массива нанопроволочных структур.
12. Проведена оптимизация условий активации массива нанопроволочных структур аффинным реагентами, специфичными к целевым белкам.
13. Разработана методика изготовления экспериментальных образцов регенерируемого нанопроволочного биосенсора.
14. Разработана методика регенерации биосенсора, позволяющая проводить 5 циклов регенерации.
15. Разработана методика получения конъюгатов квантовых точек с детекторными антителами, высокоспецифичными к маркерам рака молочной железы и рака простаты.
16. Изготовлены экспериментальные образцы конъюгатов детекторных антител, специфичных к простатическому специфическому антигену, с квантовыми точками.
17. Разработана программа и методика испытаний экспериментальных образцов конъюгатов детекторных антител с квантовыми точками.
18. Осуществлено материально-техническое обеспечение работ.
19. Изготовлены экспериментальные образцы биосенсора.
20. Разработана методика экспериментальных исследований оптических свойств и морфологии фотонных кристаллов на основе кремниевых нанопроволок (подложки биосенсора), а также оптических характеристик получаемых биосенсоров.
21. Разработаны программы и методики экспериментальных исследований экспериментальных образцов биосенсоров.
22. Разработан способ корпусирования биосенсора для адаптации конструкции к применению в стандартных флюоресцентных ридерах для ИФА.
Коллективом исполнителей со средним возрастом в 33 года опубликовано, на конец 2015 г., три работы в изданиях, цитируемых в базах данных Scopus или Web-of-Science, подготовлен один патент и принято участие в четырех мероприятиях по демонстрации и популяризации результатов проекта.
Коллективом привлечено 2,12 млн. руб. внебюджетных средств, использовано в работе шесть уникальных научных установок, а также два центра коллективного пользования НИЯУ МИФИ.