Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка опто- и хемогенетических методов регистрации и коррекции нарушения нейрогенеза

Номер контракта: 14.575.21.0074

Руководитель: Касымов Виталий Анварович

Должность: Заведующий Лабораторией нейробиологии и медицинской физики

Организация: федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Балтийский федеральный университет имени Иммануила Канта"
Организация докладчика: Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Балтийский федеральный университет имени Иммануила Канта"

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
астроциты, нейроны, нейрогенез, управление функцией клеток, dreads, хемогенетика, оптогенетика.

Цель проекта:
1. Проект направлен на раскрытие фундаментальных механизмов астроцитарной регуляций нейрональной функции в одном из важнейших регуляторных процессов, осуществляемом ЦНС – контроле нейрогенеза во взрослом мозге. Будут получены основополагающие данные, которые в последствии будут способствовать разработке методов профилактики и коррекции огромного круга болезней, в основе которых лежат метаболические нарушения и нейродегенерация. Создание подобных технологий направлено на решение следующих стратегических задач: 1) создание генетической конструкции, на основе адено- и/или лентивирусных векторов, обеспечивающей контролируемую экспрессию генов в нейронах и астроцитах головного мозга. 2) разработка метода и создание протокола получения модифицированной первичной культуры астроцитов и нейронов головного мозга крыс, для использования при получении генетических конструкций для управляемой, избирательной активации или ингибирования клеточных функций. 3) проведение анализа сигнальных систем астроцитов и нейронов, их общего функционального статуса при генетической модификации. 4) разработка методических рекомендаций для дальнейшего использования разрабатываемой технологии контроля нейрогенеза в испытаниях на животных моделях нейродегенеративных заболеваний. 2. Цели проекта: 1) На основе функциональных и/или генетически кодируемых сенсоров создать методы выявления нарушений нейрогенеза и средства его восстановления. 2) Разработать средства стимуляции нейрогенеза.

Основные планируемые результаты проекта:
В ходе выполнения ПНИ будут получены следующие научно-технические результаты:
1. Промежуточные и заключительный отчеты о ПНИ, содержащие:
а) анализ научно-технической литературы, нормативно-технической документации и других материалов, относящихся к разрабатываемой теме;
б) результаты анализа данных экспериментальных исследований;
в) обобщение и выводы по результатам ПНИ.
2. Отчет о патентных исследованиях, оформленный в соответствии с ГОСТ 15.011-96.
3. Экспериментальные образцы генетических конструкций на основе вирусных веторов:
- для трансфекции нейронов;
- для трансфекции астроцитов.
4. Лабораторный протокол создания генетических конструкций.
5. Лабораторный протокол специфической активации трансфецированных генетическими конструкциями нейронов и астроцитов.
6. Лабораторный протокол создания моделей культур клеток головного мозга (нейроны и астроциты) крыс.
7. Программа и методики испытаний экспериментальных образцов генетических конструкций в культурах клеток in vitro.
8. Лабораторный протокол трансфекции нейронов и астроцитов in vivo.
9. Программа и методики испытаний экспериментальных образцов генетических конструкций с целью таргетного контроля внутриклеточных каскадов in vivo.
10. Методика ингибирования и активирования катехоламинергических нейронов.
11. Лабораторный протокол ингибирования и активирования катехоламинергических нейронов.
12. Экспериментальные образцы наборов реагентов для моделирования стимуляции и восстановления нарушений нейрогенеза в головном мозге (наборы реагентов для моделирования нейрогенеза, далее – НРМН):
- НРМН для трансфекции нейронов;
- НРМН для трансфекции астроцитов.
13. Лабораторный технологический регламент изготовления НРМН.
14. Методика оценки эффективности экспериментальных образцов НРМН.
15. План исследований экспериментальных образцов НРМН для оценки их эффективности в экспериментах in vitro и in vivo.
16. Проекты инструкций по применению НРМН.
17. Технические требования и предложения по разработке, производству и эксплуатации продукции с учетом технологических возможностей и особенностей индустриального партнера - организации реального сектора экономики.
18. Проект технического задания на проведение ОТР по теме: Разработка опто- и хемогенетических методов регистрации и коррекции нарушения нейрогенеза.
Полученные в ходе реализации проекта культуры клеток нейронов и астроглии характеризуются высоким процентом выживаемости и чистоты культуры. Генетические конструкции, разработанные для специфической трансфекции нейронов и астроглии отличаются высоким и стабильным уровнем трансфекции и экспрессии репортерного белка.
Метод вирусной доставки генов в клетки мозга является передовой технологией разрабатываемой и применяемой в передовых научно-исследовательских центрах мира и имеет большой потенциал в терапии многих нейрогенеративных заболеваний.
Все требования, указанные в техническом задании, а именно: - основные требования к выполнению ПНИ (Требования к составу научно-технических результатов ПНИ), - технические требования (Требования по назначению научно-технических результатов), - требования к документации - требования к патентным исследованиям и регистрации результатов интеллектуальной деятельности, выполнены и соблюдены в полном объеме.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
1. Конечным продуктом, создаваемым с использованием результатов, планируемых при выполнении проекта, является набор реагентов для моделирования нейрогенеза, который должен удовлетворять следующим требованиям:
1) основа генетической конструкции - ленти- и/или аденоассоциированного вирусного вектора;
2) способ визуализации - химически и/или оптически;
3) размер экспериментального образца генетической конструкции - не более 25000 нуклеотидов/пар нуклеотидов;
4) специфичность к определенному типу клеток - 97%, не менее;
5) количество индуцируемых каскадов - 3, не менее;
6) токсичность - для применения in vivo (не токсично);
7) тип трансфецируемых клеток - дифференцированные.
Данный проект направлен на:
1) исследование функциональных взаимодействий астроглиальных клеток и нейронов в различных регионах головного мозга, в норме и при патологиях;
2) определение клеток-источников нейротрансмиттеров и сигнальных молекул, принимающих участие в регуляции количества их выброса, в различных участках головного мозга;
3) создание новых инструментов для точного контроля клеточных функций in vitro и in vivo через активацию или ингибирование внутриклеточных сигнальных путей, с использованием опто- и хемогенетических подходов (модифицированные свето- или хемочувствительные ионные каналы, протонные помпы, альфа и бета адренорецепторы, G-белок связывающие рецепторы q-типа, активируемых специфическими препаратами);
4) разработку новых подходов для точного контроля функций головного мозга через генетическую модификацию и регуляцию целевых клеточных популяций.
В целом, исследование направлено на разработку новых терапевтических стратегий, направленных на компенсацию утраченных функций головного мозга.
2. Одной из основных задач нейробиологии является выяснение механизмов, лежащих в основе передачи информации с одной нервной клетки на другую. В настоящее время всеобщее признание получила везикулярная гипотеза освобождения нейротрансмиттеров, по которой передача информации от одной клетки мозга к другой происходит за счет химического агента - нейротрансмиттера, который концентрируется в везикулах и выделяется из них посредством экзоцитоза.
На сегодняшний день мы имеем ограниченные знания механизмов патогенеза неврологических и метаболических болезней головного мозга, что негативно сказывается на темпах разработок новых методов лечения заболеваний ЦНС. Очевидно, что это обусловлено чрезвычайной сложностью строения нервной системы в целом, и головного мозга в особенности. Его сложнейшая система, в которой миллиарды взаимосвязанных нейронов и астроцитов, практически каждый из которых обладает своим набором уникальных характеристик, где функции обусловлены сложным переплетением миллисекундных электрических импульсов и связанными с ними мириадами молекулярных мессенджеров, образует устойчивый механизм, обеспечивающий регуляцию жизнедеятельности организма и его связь с внешним миром. Из-за чрезвычайно сложных межклеточных и межмолекулярных взаимодействий, имеющих место в головном мозге, до сих пор не достигнуто достаточной глубины понимания моделей функционирования отдельных составляющих этой комплексной системы, того, что в конечном счете приводит к таким явлениям, как эмоции и память. Кроме того, мы также не знаем молекулярной этиологии таких заболеваний как, например, болезни Паркинсона и Альцгеймера, депрессия и шизофрения.
Огромное количество исследований посвящено определению роли нейронов в функционировании головного в мозга, как в норме, так и при различных патологиях. В то же время, нейроны являются не единственными участниками процессов в центральной и периферической нервной системах. Сегодня остается все меньше сомнений в том факте, что наряду с нейронами, астроциты являются главными глиальными модификаторами нейрональной активности, выполняющие различные функции. Однако исследования, активно проводимые последние две декады, приводят нас к главной, как ныне считается, регуляторной функции астроцитов, которую они осуществляют - модулирование функций нейронов через «глиотрансмиттерную пластичность».
3. Научно-технический уровень выполняемых ПНИ соответствует лучшим достижениям в данной области. Метод вирусной доставки генов в клетки мозга является передовой технологией разрабатываемой и применяемой в передовых научно-исследовательских центрах мира и имеет большой потенциал в терапии многих нейрогенеративных заболеваний. Все требования, указанные в техническом задании, а именно: - основные требования к выполнению ПНИ (Требования к составу научно-технических результатов ПНИ), - технические требования (Требования по назначению научно-технических результатов), - требования к документации - требования к патентным исследованиям и регистрации результатов интеллектуальной деятельности, выполнены и соблюдены в полном объеме. Научно-технический уровень выполняемой НИР соответствует лучшим достижениям в данной области: подобные разработки ведутся в Стендфордском университете под руководством доктора Карла Диссерот и в Университете Бристоля под руководством доктора Каспарова.
4. Для создания генетических конструкций, позволяющих моделировать нейрогенез, используются ленти- и/или аденоассоциированные вирусные векторы, в которые с использованием технологии клонирования Golden Gate внедрен GFAP-промотор, обуславливающий клеточно-специфическую экспрессию в астроцитах. Определение изменений в специфических сигнальных путях, в модифицированных с использованием разработанных генетических конструкций клетках, производиться посредством сравнения основных клеточных сигнальных путей (пуринергический каскад, WNT-каскад), выявления изменений в механизмах и регуляции везикулярного транспорта, определения изменений экспрессии белков везикулярного транспорта. Сравнения производиться между различными популяциями астроцитов гипоталамуса, кортекса, ствола мозга и гиппокампа, а также между модифицированными и немодифицированными астроцитами. Регистрация ингибирования компонентов сигнальных и метаболических путей производиться с использованием метода конфокальной лазерной сканирующей микроскопии с флуоресцентной детекцией. Для точной количественной оценки экспрессии важнейших регуляторных генов астроцитов были применены методы секвенирования следующего поколения, позволяющие с наибольшей точность определить абсолютное количество копий мРНК соответствующих генов. Количественная оценка изменений профиля глиотрансмиттеров (глутамата, лактата, ГАМК, АТФ) производится как in vitro, так и in vivo спектрофотометрическими методами.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
1. Результаты, которые планируется получить в рамках заявляемого проекта, в дальнейшем буду использованы для создания нового типа генной терапии заболеваний, вызывающих деградацию нейронов и астроцитов. Особенностью данной технологии, основанной на вирусной трансфекции клеток, является возможность ее не инвазивного применения. При этом, оптимальным является применение хемогенетического контроля экспрессии, используя который, можно добиться специфичности экспрессии инкорпорированных генов в определенных зонах головного мозга.
2. Полученные результаты будут способствовать развитию соответствующих направлений технологической платформы «Медицина будущего» и национальной инициативы "Нейротехнологии": нейробиологии, клеточной биологии, синтетической биологии, новых систем для терапии на основе молекулярных и клеточных мишеней.
3. Работа имеет ключевое значение в развитии нейротехнологий и биомедицины будущего и направлена на поиск способов и создание заделов для нового направления клеточной нейробиологии и нейротехнологий в медицине – управления внутриклеточными функциональными системами. Социально-экономический вклад в развитие общества может быть следующим: снижение экономической нагрузки на государство путем улучшения качества жизни и увеличения трудоспособности пациентов с нейродегенеративными заболеваниями.
4. Полученные результаты могут послужить основой международного сотрудничества с целью изучения роли астроцитов в норме и при патологии, в частности, при изучении нейродегенеративных заболеваний.

Текущие результаты проекта:
В соответствии с требованиями технического задания и плана-графика выполнения ПНИ получены следующие результаты по ПНИ в целом:
1. Выполнен аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей научно-техническую проблему, исследуемую в рамках ПНИ, в том числе, обзор научных информационных источников: статьи в ведущих зарубежных и (или) российских научных журналах, монографии и (или) патенты – не менее 150 научно-информационных источников за период 2009 – 2014 гг.
2. Проведены патентные исследования по ГОСТ 15.011-96.
3. Разработана генетическая конструкция на основе вирусного вектора и синтезированных нуклеотидов.
4. Разработан лабораторный протокол для создания генетической конструкции на основе вирусного вектора и синтезированных нуклеотидов.
5. Проведена сравнительная оценка эффективности возможных направлений исследований.
6. Разработаны варианты возможных решений задачи, выбран и обоснован оптимальный вариант технического решения задач.
7. Проведены выбор и обоснование методов решения поставленных в ПНИ задач.
8. Разработана программа и методики испытаний 􀀀экспериментальных образцов генетических конструкции 􀀀в культурах клеток in vitro.
9. Исследован экспрессионный профиль астроцитов.
10. Разработан лабораторный протокол трансфекции нейронов и астроцитов in vivo.
11. Разработан лабораторный протокол специфическои 􀀀 активации трансфецированных генетическими конструкциями нейронов и астроцитов.
12. Определены изменения в специфических сигнальных путях in vitro в трансфецированных генетическими конструкциями клетках.
13. Проведены испытания экспериментальных образцов генетических конструкций в культурах клеток in vitro.
14. Разработана программа и методики испытаний 􀀀экспериментальных образцов генетических конструкции с целью таргетного контроля внутриклеточных каскадов in vivo.
15. Проведена количественная оценка везикулярного транспорта астроцитов.
16. Проведена количественная оценка изменений профиля глиотрансмиттеров астроцитов in vitro и in vivo.
Все требования на 2014 и 2015 гг., указанные в техническом задании, выполнены и соблюдены в полном объеме.
Научно-технический уровень выполняемых ПНИ соответствует лучшим достижениям в данной области. Поставленные задачи выполнения первых трех этапов прикладных научных исследований в целом решены полностью.