Регистрация / Вход
Прислать материал

Сенсорные системы на основе lux-оперонов для детекции различных групп токсических и биологически активных веществ.

Номер контракта: 14.576.21.0011

Руководитель: Завильгельский Геннадий Борисович

Должность: Главный Научный Сотрудник

Организация: федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов"
Организация докладчика: Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов"

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
биолюминесценция, escherichia coli, биосенсор, индуцируемый промотор, люцифераза,биологический анализ токсичности

Цель проекта:
Создание комплекса быстрых, чувствительных и специфичных тест-методик для мониторинга окружающей среды является в настоящее время актуальной задачей, поставленной перед ученым сообществом. Растущие с каждым годом объемы различных химических соединений, продукция нанотехнологической промышленности, широкое использование различных биологически активных веществ (наркотические соединения, антибиотики и др.) требуют проведения быстрого и строгого контроля качества окружающей среды, в особенности, водных ресурсов и пищевых продуктов, непосредственно влияющих на здоровье людей. Цель проекта - разработка высокочувствительных, специфических тест-систем (lux-биосенсоры), способных фиксировать стрессовые реакции (SOS-ответ, «тепловой шок», окислительный стресс), индуцируемые в клетке токсическими агентами и биологически активными веществами, детекция ионов металлов и металлоидов, антибиотиков, аутоиндукторов, а также разработка проектов методик использования тест-систем (групп lux-биосенсоров) для определения природы токсичности веществ.

Основные планируемые результаты проекта:
Будут созданы несколько групп специфических lux-биосенсоров (сенсорных биолюминесцентных тест систем), при конструировании которых используются как гибридные плазмиды, так и специально подобранные штаммы бактерий: высоко специфические lux-биосенсоры для определения в среде ионов ртути, кадмия, меди, серебра, цинка, свинца, мышьяка, сурьмы: P-MerR, P-CopA, P-ArsR, P-ZntA;
Высоко специфические lux-биосенсоры для обнаружения в среде антибиотиков тетрациклинового ряда, бета-лактамного ряда, фторхинолонов, аминогликозидов, макролидов, низина: P-TetR, P-AmpC, P-IbpA, P-ColD, P-MphA, P-NisA. Высоко специфические lux биосенсоры для обнаружения в среде аутоиндукторов, определяющих коммуникацию бактериальных клеток в популяции: P-LuxR, P-LsrA.
Lux-биосенсоры для детекции спектра токсических веществ, повреждающих ДНК клетки (генотоксическое действие): P-ColD, P-RecA, P-DinI, P-AlkA. Lux-биосенсоры для детекции спектра токсических веществ, повреждающих белки в клетке: P-GrpE, P-IbpA, P-RpoE. Lux-биосенсор для детекции спектра токсических веществ, повреждающих мембраны клетки: P-FabA. Lux-биосенсоры для детекции спектра токсических веществ, индуцирующих формирование в клетке активных форм кислорода (перекись водорода, супероксид анион):P-KatG, P-SoxS, P-OxyS, P-IscRUSA. Lux-биосенсоры P-Xen7, P-Leo1 для определения интегральной токсичности.
Будут разработаны методики использования групп lux-биосенсоров (тест-систем).
Использование lux-биосенсоров по сравнению с физическими и химическими методами определения токсичности веществ характеризуется простотой использования и низкими эксплуатационными расходами. Использование специфических индуцируемых lux-биосенсоров позволяет определять способ воздействия токсического вещества на клетку.


Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
В рамках настоящего проекта будет создан комплекс высокочувствительных и специфических lux-биосенсоров (Escherichia coli с гибридными плазмидами), содержащих в качестве генов-репортеров гены luxCDABE Photorhabdus luminescens, а в качестве регулируемых элементов различные индуцируемые промоторы. Созданный комплекс lux-биосенсоров на основе биолюминесцентных сигнальных систем предназначен для применения в экологии (мониторинг окружающей среды - воды, почвы, воздуха), в пищевой и, в частности, молочной промышленности, в космической экологии, в медико-гигиенических исследованиях и фармакологии, в научных исследованиях. Сконструированные lux-биосенсоры имеют конкурентные преимущества по сравнению с имеющимися аналогами ("Микротокс", "Биотокс 7" и др.) за счет: высокой чувствительности; высокой специфичности; сравнительно небольшого интервала времени, необходимого для фиксации эффекта (15 - 30 мин.); количественной оценки эффекта в широких пределах (несколько порядков); низких эксплуатационных расходов сравнительно невысокой стоимости оборудования; простоты использования; способности выявления дополнительных важных свойств объекта и др.
За рубежом специфические индуцируемые lux-биосенсоры используются с успехом для детекции токсических веществ и для анализа генетических процессов в клетке. Так, например, в Финляндии lux-биосенсоры применяют для детекции антибиотиков в молочных продуктах (Karp M. et al.), в Ю. Кореи и Англии– lux-биосенсоры применяют для детекции генотоксических агентов (Gu M. et al.; Paton J. et al.), в США – для определения токсических веществ, повреждающих белки, мембраны и ДНК (Van Dyk T.K. et al.). В России подобные разработки отсутствуют. Конструированием специфических lux-биосенсоров занимается лишь наша группа сотрудников во главе с д.б.н., проф. Г.Б. Завильгельским («ГосНИИгенетика»). Сконструированные нами биосенсоры на основе lux-генов и регулируемых промотров являются патентоспособными, так как оригинальны, высокочувствительны и высокоспецифичны для детекции того или иного токсина.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Основные области применения сенсорных биолюминесцентных систем:
1) в области военной и космической экологии – детекция гептила и его производных, ОВ, тяжелых металлов и других токсичных соединений,
2) в области общей экологии – детекция тяжелых металлов, диоксинов и других токсичных соединений,
3) в пищевой промышленности – детекция тяжелых металлов, диоксинов, антибиотиков,
4) в фарминдустрии и медицине – мониторинг лекарственных препаратов и обнаружение сигнальных молекул (автоиндукторов), обеспечивающих патогенным бактериям осуществление коллективных инфекций.
Применение разрабатываемого набора lux-биосенсоров позволит предотвратить опасность, возникающую при использовании токсичных веществ. Исследование механизмов действия токсичных веществ с использованием раз-рабатываемого набора биосенсоров может приводить к пересмотру областей примене-ния биологически активных веществ.
После проведения ОКР, сертификации методики использования тест-систем на основе специфических lux-биосенсоров для определения природы токсичности ве-ществ, патентования возможна коммерциализация результатов исследования с образо-ванием нового юридического лица или в рамках ФГУП «ГосНИИгенетика». Реализация возможна как в виде продаж тест-наборов lux-биосенсоров, так и в виде услуг, предоставляемых заинтересованным лицам.

Текущие результаты проекта:
В результате работ отчетного этапа были сконструированы 12 специфических индуцируемых lux-биосенсоров в т.ч.: биосенсор P-ZntA -для определения в среде ионов цинка, свинца; биосенсор P-MphA- для детекции антибиотиков макролидов; P-NisA- для детекции низина; P-RecA, P-SOSdin, P-AlkA - для детекции токсических веществ, повреждающих ДНК клетки (генотоксическое действие); P-LsrA - для детекции аутоиндукторов II типа; P-OxyS, P-IscRUSA для детекции спектра токсических веществ, индуцирующих формирование в клетке активных форм кислорода (перекись водорода, супероксид анион); P-GrpE, P-RpoE - для детекции токсических веществ, вызывающих повреждения белков в клетке; P-FabA - для детекции токсических веществ, повреждающих мембраны клетки. Сконструированные lux-биосенсоры пополнили семь групп Тест-систем для определения природы токсических веществ. Сконструированные при проведении работ 1 и 2 этапов биосенсоры были объединены в 8 групп - Тест-системы для oпределения прирoды тoксичнoсти веществ. Были разработаны соответствующие паспорта с указанием области применения Тест-системы, перечня биосенсоров, входящих в состав Тест-системы, условий культивирования биосенсорных штаммов, пороговых концентраций стандартов, определяемых биосенсорами.
При выполнении работ заключительного этапа будут разработаны проекты методик использования сконструированных Тест-систем для определения природы токсичности веществ.