Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка технологии картирования сайтов метилирования de novo в геноме человека (эпигенетического секвенирования) на автоматических секвенирующих машинах нового поколения (NGS). Разработка сервиса обработки данных по результатам эпигенетического секвенирования

Номер контракта: 14.576.21.0072

Руководитель: Дегтярев Сергей Харитонович

Должность: Заместитель директора по науке ООО "СибЭнзайм"

Организация: Общество с ограниченной ответственностью "СибЭнзайм"
Организация докладчика: Общество с ограниченной ответственностью «СибЭнзайм»

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
эпигенетика, эпигеном, метилом, секвенирование нового поколения, карта функционального метилирования

Цель проекта:
1. Формулировка задачи/проблемы, на решение которой направлен реализуемый проект. Одним из ключевых направлений современной медицины является развитие персонализированной медицины. В рамках персонализированной медицины основной упор делается на регулярные обследования человека и индивидуализацию его лечения на основе знаний о структуре генов пациента. Развитие геномных технологий сегодня дает возможность устанавливать и анализировать структуру генов пациента, что позволяет определять наличие наследственных болезней, судить о предрасположенности к ряду заболеваний, оценивать эффективность применения тех или иных медицинских препаратов и использования различных методов лечения. Однако помимо данных о структуре генов необходимо знать работают ли эти гены, то есть, являются ли они активными. Огромное число заболеваний связано именно с прекращением функционирования генов, в частности, развитие онкологических заболеваний связано с инактивацией (выключением) ряда генов-онкосупрессоров. Метилирование регуляторных областей генов de novo осуществляется в клетках человека и млекопитающих ДНК-метилазами Dnmt3a и Dnmt3b, которые метилируют не просто цитозины, а цитозиновые основания в сайтах RCGY (где R означает A или G, а Y означает T или C). При этом происходит образование последовательностей R(5mC)GY, наличие которых в регуляторных областях и приводит к выключению генов. Таким образом, именно метилирование сайтов RCGY в области промотора и первого экзона приводит к изменению статуса метилирования гена и его выключению. Такое метилирование ДНК de novo является функциональным метилированием, так как оно "выключает" определенную функцию, например, вследствие отсутствия в клетке белка, кодируемого выключенным геном. Такое метилирование de novo представляет собой механизм эпигенетической регуляции активности генов. Открытие метилзависимых сайт-специфических ДНК-эндонуклеаз (MD, methylation directed), расщепляющих только метилированную ДНК в строго определенном месте (http://mebase.sibenzyme.com/md-endonucleases), привело к созданию новых методов определения статуса метилирования генов. MD-эндонуклеаза GlaI узнает и расщепляет как раз сайт R(5mC)GY, (и никакие другие), что позволяет использовать данный фермент для выявления именно метилированных de novo сайтов, а не всех метилированных цитозинов. Предлагаемый проект ставит своей целью разработать простой и надежный метод картирования в геноме человека сайтов R(5mC)GY для определения статуса метилирования регуляторных областей генов и, соответственно, их активности (метод эпигенетического секвенирования). В ходе проекта будет разработан уникальный сервис обработки данных, включающий в себя управляющую блок-схему, адаптирующую программное обеспечение CLC Bio/CLC Genomic Workbench, и структурированную базу данных для хранения получаемой информации по распределению сайтов R(5mC)GY в геноме человека. В целом сервис обработки данных будет предназначен для интерпретации и сбора информации по результатам эпигенетического секвенирования. Для достижения целей проекта требуется решить ряд задач, основными из которых являются: - Разработка метода пробоподготовки ДНК для эпигенетического секвенирования на NGS-машинах. Для решения данной задачи должна быть отработана технология гидролиза геномной MD-эндонуклеазой GlaI, узнающей и расщепляющей сайты 5’- R(5mC)GY с образованием тупых концов. Должна быть отработана методика элюции из геля фрагментов ДНК, получаемых после гидролиза GlaI и имеющих размер 50-400 п.н. Должен быть выполнен подбор адаптеров и определены условия лигирования получаемых фрагментов ДНК с адаптером. - Получение карт распределения метилированных сайтов R(5mC)GY в препаратах ДНК из клеточной линии фибробластов легких человека L-68 (здоровые клетки) и малигнантных клеточных линий человека Raji, Jurkat, U-937 и HeLa. Клеточные линии являются моделями соответствующих тканей организма в различных состояниях (норма или опухоль) и представляют собой удобный объект для эпигеномного секвенирования и картирования сайтов R(5mC)GY. Для решения данной задачи должны быть проведены экспериментальные исследования на NGS-машине (например, "MySeq" (Illumina, США) или "IonTorrent" (Applied Biosystems, США)). - Разработка алгоритма обработки данных секвенирования геномной ДНК после гидролиза ферментом GlaI и сравнения получаемых последовательностей фрагментов со структурой генома человека для определения позиций метилированных сайтов R(5mC)GY. - Разработка управляющей блок-схемы (worksheet), адаптирующей программное обеспечение CLC Bio/CLC Genomic Workbench для осуществления функций позиционирования и определения сайтов R(5mC)GY в структуре генома человека по данным эпигенетического секвенирования. - Разработка формата хранения получаемой информации с целью последующего создания базы данных распределения сайтов R(5mC)GY в геномах клеточных линий человека и в ДНК различных тканей человека в зависимости от пола, возраста и наличия заболеваний. 2. Формулировка целей реализуемого проекта: - Разработка нового метода картирования сайтов метилирования de novo R(5mC)GY в геноме человека, базирующегося на использовании метилзависимой ДНК-эндонуклеазы GlaI и высокопроизводительных секвенирующих машин нового поколения (NGS-машин). - Разработка сервиса обработки данных по картированию сайтов метилирования de novo в геноме человека.

Основные планируемые результаты проекта:
1. Краткое описание основных результатов (основные практические и экспериментальные результаты, фактические данные, обнаруженные взаимосвязи и закономерности):
- Новый метод эпигенетического секвенирования, представляющий собой технологию картирования сайтов метилирования de novo в геноме человека на автоматических секвенирующих машинах нового поколения (NGS), основанную на использовании метилзависимой ДНК-эндонуклеазы GlaI.
- Набор пробоподготовки геномной ДНК для эпигенетического секвенирования на NGS-машинах.
- Снижение стоимости и затрат времени на пробоподготовку при полногеномном эпигенетическом профилировании в сравнении с существующими методами, основанными на бисульфитной обработке ДНК.
- Сервис обработки данных по картированию сайтов R(5mC)GY в геноме человека и формированию структурированной базы данных для хранения получаемой информации.
- Разработанное и адаптированное программное обеспечение, не требующее мощных вычислительных кластеров и позволяющее проводить анализ данных на настольных компьютерах.
- Эпигенетические карты сайтов метилирования de novo R(5mC)GY в препаратах ДНК из клеточных линий человека (L-68, U-937, Raji).

2. Основные характеристики планируемых результатов (в целом и/или отдельных элементов), научной (научно-технической, инновационной) продукции:
1) Разрабатываемый новый метод эпигенетического секвенирования на NGS-машинах предназначен для создания карт сайтов в геноме человека, метилированных клеточными метилазами dnmt3a и dnmt3b (карт функционального метилирования).
2) Экспериментальный образец набора реагентов предназначен для подготовки проб ДНК к эпигенетическому секвенированию на NGS-машинах.
3) Сервис обработки данных предназначен для интерпретации и сбора информации по результатам эпигенетического секвенирования.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
1. Описание конечного продукта, создаваемого с использованием результатов, планируемых при выполнении проекта, места и роли проекта и его результатов в решении задачи/проблемы.
1.1. Разрабатываемый метод эпигенетического секвенирования должен быть основан на использовании метилзависимой ДНК-эндонуклеазы GlaI.
1.2. Экспериментальный образец набора реагентов для пробоподготовки ДНК к эпигенетическому секвенированию на NGS-машинах должен удовлетворять следующим характеристикам:
- набор должен включать специфические олигонуклеотидные адаптеры, ферментные препараты для фрагментации ДНК, MD-эндонуклеазу GlaI, ферментные препараты для лигирования ДНК, реакционные буферы, инструкцию по применению;
- электрофоретический анализ фрагментов гидролиза геномной ДНК человека ферментными препаратами для фрагментации ДНК, входящими в состав набора реагентов, должен соответствовать расчетным длинам;
- в результате гидролиза каждого микрограмма геномной ДНК человека MD-эндонуклеазой GlaI получаемая целевая фракция фрагментов с длиной 50-400 п.н. должна составлять не менее 5 нг ДНК;
- активность ферментных препаратов набора реагентов при условии хранения при минус 20°С в течение 3 месяцев не должна падать более, чем на 10%;
- исходный объем реагентов должен быть достаточным для подготовки 100 проб ДНК плюс 10% объема на неспецифические потери материала;
- время обработки набором для подготовки геномной ДНК человека к эпигенетическому NGS-секвенированию не должно превышать 4-х часов.
1.3. Сервис обработки данных эпигенетического секвенирования должен включать в себя:
- программное обеспечение (ПО) для предварительного анализа и отбраковки данных NGS;
- рабочую блок-схему, адаптирующую программное обеспечение CLC Bio/CLC Genomic Workbench для трактовки результатов эпигенетического секвенирования и создания карт сайтов функционального метилирования (РБС);
- формат структурированной базы данных для хранения накопленной полезной информации по метилированию de novo (ФБД).
1.3.1. Сервис обработки данных эпигенетического секвенирования должен обладать следующими основными характеристиками:
- сервис должен устанавливаться на обычный PC-совместимый компьютер/рабочую станцию/кластер;
- минимальная конфигурация компьютера для установки сервиса должна иметь 4 аппаратных ядра с минимальным объёмом оперативной памяти 4 Гигабайта на ядро и размером носителей не менее 2 Тб.
- сервис должен использовать доступные пользователям операционные системы: MS Windows 2012 Server (минимальный вариант способен работать на MS Windows 7), Linux (Debian-совместимый);
1.3.2. ФБД должен использовать следующие условия для работы:
- для старта и тестирование системы использовать выделенный сервер (2 ядра минимум, 2 Гб оперативной памяти минимум, RAID6/RAID60, ОС FreeBSD/Debian), 100 Мбит LAN;
- для дальнейшей работы – использовать ступенчатое увеличение мощности, поддерживая уровень загрузки не более 70%.
1.3.3. ПО для предварительного анализа и отбраковки данных NGS должно быть предназначено для коррекции ошибок NGS; удаления последовательностей, не относящихся к метилированным сайтам; подготовке данных для CLC Bio/CLC Genomic Workbench. Оно должно устанавливаться на ту же рабочую станцию/персональный компьютер, параметры которого указаны в п. 1.3.1.
1.3.4. РБС должна применяться с программным обеспечением CLC Bio/CLC Genomic Workbench) на той же рабочей станции/персональном компьютере, параметры которого указаны в п. 1.3.1.

2. Оценка элементов новизны научных (технологических) решений, применявшихся методик.
Предлагаемый новый метод эпигенетического картирования основан на применении MD-эндонуклеазы GlaI, впервые открытой и описанной в нашей компании. GlaI расщепляет ДНК по сайтам R(5mC)^GY (как указано стрелкой) с образованием тупых концов, гидролизует ДНК полностью, продукты гидролиза не нуждаются в дополнительной обработке и сразу пригодны для пришивки адаптеров, с которых и определяется структура ДНК в процессе эпигенетического секвенирования на NGS-машинах.
Применение фермента GlaI на этапе пробоподготовки, последующее секвенирование полученных фрагментов ДНК и наложение полученной нуклеотидной последовательности фрагментов на известную структуру генома человека позволит установить положение сайтов R(5mC)GY в изучаемом геноме. Таким образом, в отличие от бисульфитной конверсии ДНК, использование GlaI в пробоподготовке ДНК позволяет определять именно сайты R(5mC)GY, устанавливать статус метилирования генов с высокой точностью и значительно меньшими затратами, что определяет актуальность и новизну данной работы.
Картирование сайтов R(5mC)GY в геноме человека является новым применением секвенаторов нового поколения (NGS-машин), используемых для полногеномного секвенирования.
Фермент GlaI запатентован и производится только в компании «СибЭнзайм» (Новосибирск, Россия). Аналогов его в мире нет.
В рамках проекта поданы 2 заявки на патенты:
1) Изобретение заявка № 2015117897 от 13.03.2015 г. «Способ картирования положений ряда метилированных нуклеотидных последовательностей Pu(5mC)GPy в протяженной ДНК для построения эпигенетического профиля и выявления аномально метилированных участков ДНК», РФ.
2) Изобретение заявка № 2015118601 от 19.05.2015 г. «Способ сайт-специфического гидролиза С5-метилированной последовательности ДНК», РФ.

3. Сопоставление с результатами аналогичных работ, определяющими мировой уровень.
Сегодня для определения в геноме человека 5-метилцитозинов и сайтов, содержащих 5-метилцитозин (включая сайты R(5mC)GY), используется исключительно химический метод бисульфитной конверсии ДНК. В результате реакции бисульфитной конверсии цитозиновые основания в ДНК превращаются в урацил, тогда как 5-метилцитозин устойчив к этой реакции. Последующий анализ исходной и модифицированной ДНК различными методами позволяет определить положение метилированных цитозинов в исследуемой ДНК.
Следует отметить, что метод бисульфитной конверсии имеет существенные недостатки, часто дает неоднозначные и трудновоспроизводимые результаты (особенно при работе с геномной ДНК), что связано как со сложностью самой методики, так и с развалом и неполной конверсией ДНК. Никаких других методов определения эпигенома на сегодня не существует, как не существует и метода избирательного определения сайтов R(5mC)GY на уровне всего генома человека.
Метод бисульфитного секвенирования позволяет определить наличие 5-метилцитозинов только в неповторяющихся областях ДНК, т.е. собственно в генах и их ближайшем окружении. Однако гены и их окружение составляют менее 5% генома человека, тогда как метилирование реализуется по всему геному, включая и повторы. Метилирование повторов доказано и его роль в функционировании генома млекопитающих не вызывает сомнений, но оно не достаточно изучено вследствие сложности методов исследования.
Хотя метод бисульфитной конверсии неплохо зарекомендовал себя при работе с небольшими фрагментами ДНК, он обладает рядом существенных недостатков, связанных в первую очередь со сложностью методики бисульфитной конверсии:
а) при недостаточной конверсии возникают пропуски сайтов метилирования;
б) при избыточной конверсии происходит разрушение ДНК;
в) метод не позволяет определять только сайты R(5mC)GY, а определяет метилированные цитозины, что существенно затрудняет последующий анализ данных;
г) большое количество необходимой для анализа ДНК (>500 пг);
д) многостадийный процесс большой длительности.
Совокупность указанных факторов делает возможным применение метода при анализе сравнительно небольших фрагментов ДНК. При определении эпигенома метод дает большое количество ошибок и отличается низкой воспроизводимостью результатов.
Альтернативным способом определения статуса метилирования участков ДНК является использование эндонуклеаз рестрикции, блокируемых метилированнием цитозиновых оснований в сайтах узнавания. Чаще всего используется пара эндонуклеаз HpaII и MspI, которые узнают тетрануклеотидную последовательность CCGG, но блокируются по-разному: MspI не расщепляет последовательность (5mC)CGG, а HpaII — C(5mC)GG (Zilberman and Henikoff 2007) . В случае метилирования внутреннего CG-динуклеотида этого сайта он будет расщепляться эндонуклеазой MspI и амплификация фрагмента ДНК, содержащего внутри этот сайт, происходить не будет, тогда как HpaII такой сайт не расщепляет и в ходе ПЦР будет происходить наработка фрагмента ДНК.
Недостатком использования HpaII и MspI является то, что последовательность CCGG отличается от RCGY и не является сайтом метилирования de novo, таким образом, эти ферменты не могут быть использованы для выявления сайтов R(5mC)GY.
Сайты узнавания других эндонуклеаз рестрикции (HhaI, AciI и некоторые другие) включают в себя лишь некоторые из возможных сайтов с формулой RCGY. При этом, они не имеют изошизомеров, аналогичных паре HpaII и MspI и отличающихся по чувствительности к метилированному основанию в CG-динуклеотиде (что желательно для наличия положительного контроля в экспериментах).
Использование же для изучения статуса метилирования ДНК метилзависимых эндонуклеаз, которые специфически фрагментируют только метилированную ДНК, позволяет разработать прямой метод определения метилированных сайтов и существенно упростить схему проведения анализа при сохранении высоких показателей чувствительности и специфичности. Недавно зарубежными исследователями в этих целях был использован фермент McrBC, который узнает последовательность R(mC)N40-2000R(mC) и расщепляет ее вблизи от одного из двух узнаваемых динуклеотидов. В настоящее время такой подход используется только в научно-исследовательских работах и в клинической практике пока не применяется. Использование эндонуклеазы McrBC для анализа наличия метилированой ДНК имеет ряд недостатков. В частности, McrBC узнает последовательность из двух метилированных цитозиновых оснований, удаленных на значительное расстояние друг от друга, что исключает возможность определения сайта 5’-R(5mC)GY-3’в выбранном положении генома.
Применение вместо фермента McrBC MD-эндонуклеазы GlaI, сайт узнавания которой полностью соответствует продукту реакции, образующемуся при метилировании ДНК de novo клеточными метилазами DNMT3a и DNMT3b, позволяет избавиться от данного недостатка.
Существует также подход, определяющий активность генов в геноме по наличию РНК-продуктов этих генов — метод определения транскриптов. Этот метод определяет, наоборот, активные, а не выключенные гены. При определении транскриптов сначала выделяется РНК, затем с нее получают ДНК-копии и, наконец, определяют структуру этих ДНК-копий. Метод определения транскриптов не относится к ДНК-диагностике, он определяет активность генов опосредованно через анализ РНК, его результат зависит от времени жизни конкретной РНК (как правило, РНК быстро распадается), и он достаточно сложный в сравнении с предлагаемым методом эпигенетического секвенирования, который значительно проще и надежнее метода определения транскриптов. При этом результаты именно эпигенетического секвенирования (а не анализ транскриптов) необходимы, чтобы иметь базу стандартных карт метилирования de novo по сайтам R(5mC)GY для их дальнейшего использования в рутинной клинической практике с применением более простого метода GLAD-ПЦР-анализа (Кузнецов и др. 2013).

Основные преимущества разрабатываемого метода эпигенетического секвенирования:
Аналогов разрабатываемого метода в России и за рубежом нет.
Разрабатываемый метод прост и лишен недостатков приведенных выше альтернативных методов:
а) гидролиз происходит полностью и воспроизводим на одних и тех же ДНК матрицах;
б) разрушения ДНК не происходит;
в) происходит анализ только функциональных сайтов метилирования ДНК;
г) позволяет проводить анализ метилирования de novo по сайтам R(5mC)GY не только генов, но и повторов (в частности Alu-повторов);
д) простой процесс пробоподготовки небольшой длительности (< 4-5 часов).

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
1. Области применения результатов: эпигенетическая диагностика, персонализированная медицина, поиск новых эпигенетических маркеров, в т. ч. и для онкозаболеваний.
Метод картирования сайтов метилирования de novo R(5mC)GY в геноме человека может быть использован для поиска эпигенетических маркеров онкопатологий и иных заболеваний, для выявления тканеспецифических различий генома многоклеточного организма, для изучения изменений метилирования генома в процессе развития и старения.

2. Практическая значимость:
- предоставление научно-исследовательским организациям нового и эффективного метода эпигеномного секвенирования и программного обеспечения для обработки данных по сайтам метилирования de novo R(5mC)GY в геноме человека;
- получение значимых научных результатов и создание базы данных сайтов метилирования de novo R(5mC)GY, что будет существенным пополнением знаний о регуляции активности генов человека;
- повышение эффективности применения секвенирующих машин нового поколения (NGS) путем выполнения на них работ по эпигеномному секвенированию по новому разрабатываемому методу.
В настоящее время стоимость секвенирования на NGS-машинах с каждым годом снижается, что позволит через несколько лет активно применять его на практике для диагностики широкого спектра заболеваний и оценки различных функциональных состояний организма человека.
В результате выполнения проекта будет получена технология составления эпигенетических карт человека. Эпигенетическое картирование различных тканей в норме и при патологиях позволит создать стандартные диагностические карты, по которым можно будет проводить диагностику и превентивное лечение заболеваний на ранних стадиях, в том числе особо опасных инфекций, болезней сердечнососудистой системы и онкозаболеваний.
Внедрение в широкую практику эпигенетического картирования и сравнение полученных карт со стандартными диагностическими картами позволит резко снизить человеческие потери в результате поздно диагностированных опасных состояний организма, особенно тех, начальные этапы которых проходят бессимптомно (болезни сердечнососудистой системы, онкозаболевания, некоторые особо опасные инфекции и др.).
Кроме того, в случае обнаружения зарождающейся болезни можно будет подобрать максимально эффективное лечение, основываясь на активности генов, отвечающих за метаболизм медикаментозных препаратов, что снизит время пребывания пациентов в стационарах.
В качестве конечных потребителей можно рассматривать:
1) Российские научно-исследовательские институты, а также частные российские и зарубежные научно-исследовательские центры и компании, заинтересованные в анализе статуса метилирования ДНК, разработке новых методов диагностики наследственных, онкологических и инфекционных заболеваний, основанных на информации, полученной в ходе исследования статуса метилирования генома.
2) Диагностические центры и компании, которые заинтересованы в получении эпигенетических карт конкретных пациентов.
В будущем возможно создание первого коммерческого центра эпигенетического секвенирования, например, подобного центрам, проводящим традиционное секвенирование.

Таким образом, с использованием разработанного в данном проекте технологии картирования сайтов метилирования при помощи MD-эндонуклеазы GlaI, получены первые результаты, подтверждающие эффективность нового метода для установления эпигенетических различий в геномах клеточных линий. Это позволяет расширить спектр существующих методов эпигенетического анализа и, безусловно, найдет применение в диагностике онкопатологий при дальнейшем развитии и удешевлении секвенирующих машин новых поколений.
Подобные карты могут быть в дальнейшем использованы для выявления биомаркеров различных заболеваний, связанных с эпигенетическими изменениями (прежде всего, онкопатологий), установления тканевых эпигенетических различий, изучения процессов клеточной дифференцировки и т.д. Поэтому, разрабатываемый в данном проекте метод картирования метилированных сайтов, может оказаться востребованным и расширить возможности анализа эпигенетических изменений.


Текущие результаты проекта:
- Усовершенствована схема выделения метилзависимой эндонуклеазы GlaI, позволяющая получать препараты высокой степени чистоты и активности.
- Установлено, что добавление DMSO в реакционную смесь (до 15-25%) повышает активность фермента GlaI более, чем на порядок, что позволяет значительно сократить время пробоподготовки.
- Подобраны условия по получению препаратов GlaI-гидролизатов для эпигеномного секвенирования, на основе которых составлен лабораторный регламент гидролиза геномной ДНК ферментом GlaI и элюции целевых фрагментов, пригодных для эпигенетического секвенирования, из геля.
- Разработан алгоритм обработки данных секвенирования геномной ДНК после гидролиза ферментом GlaI и Сервис обработки данных эпигенетического секвенирования, в составе:
• Программная документация: текст программы «ResultPrep» и Руководство пользователя;
• РБС (рабочая блок-схема);
• ФБД (формат базы данных).
Использование программы «ResultPrep» для предварительной обработки данных секвенирования, поступающих с NGS-машин, позволяет производить фильтрацию сиквенсов и, таким образом, обеспечивает быстрое установление позиций метилирования в геноме человека. Суммирование полученных данных по метилированию сайтов узнавания GlaI для каждого секвенированного генома, выраженное в табличном или графическом виде, представляет собой эпигенетическую карту метилирования данного генома.
Разработанная РБС полуавтоматической обработки данных, адаптирует программное обеспечение «CLC Bio/CLC Genomic Workbench» для трактовки результатов эпигенетического секвенирования и создания карт сайтов функционального метилирования de novo R(5mC)GY. Проведено тестирование рабочей блок-схемы на данных секвенирования клеточных линий человека L-68, Raji, U-937. По результатам работы РБС определены позиции метилированных сайтов R(5mC)GY в геноме человека.
ФБД для хранения эпигенетических карт сайтов метилирования позволяет в дальнейшем разрабатывать инструментарий, позволяющий использовать базу данных для любых задач, связанных с определением и картированием сайтов метилирования в ДНК человека.
- Разработан метод картирования сайтов метилирования de novo R(5mC)GY в геноме человека (эпигенетического секвенирования).
- Разработан и изготовлен экспериментальный образец набора реагентов для пробоподготовки ДНК к эпигенетическому секвенированию на NGS-машинах. Оптимизирована схема пробоподготовки, в которой затраченное время сократилось до ~ 3 часов 15 минут.
- Проведенное картирование референсного генома человека показало, что распределение достоверно покрытых участков генома коррелирует с таковым для генов, кодирующих участков ДНК и CpG-островков. Это свидетельствует о том, что разработанный метод охватывает значительное число функционально значимых последовательностей генома.
- Проведено сравнение результатов эпигенетического секвенирования генома линии Raji на NGS-машинах MiSeq и GAIIx. Две полученные базы данных различаются лишь на 1,8%, что свидетельствует о высокой воспроизводимости разработанного метода.
- Проведено сравнение результатов секвенирования с ранее полученными данными для ряда генов-онкосупрессоров. Так, для генома Raji в регуляторных участках генов SEPT9b, IGFBP3, SFRP1, TWIST1, DAPK1, CEBPD, HS3ST2 выявлено большое число достоверно метилированных остатков (сумма расщеплений 30-200), а в участках генов MGMT и RASSF2 модифицированные остатки не обнаружены, что полностью соответствует выводам о статусе метилирования этих генов, сделанным на основании ПЦР-анализа.
- Подтвержден вывод о большом числе метилированных генов в геноме Raji, сделанный ранее на основании ПЦР-анализа. Сравнение с базой данных «Tumor Suppressor Gene Database» показало, что 579 из 716 известных генов-онкосупрессоров (80,9%) метилированы в геноме Raji.
- Показано существенное увеличение степени метилирования CpG-островков и условных регуляторных участков генов в геномах малигнантных клеток Raji и U-937 по сравнению с геномом нормальных клеток L-68.
- Созданы подвыборки генов, метилированных в каждом из геномов, и определено число общих элементов для каждой группы.
- Проведен GO-анализ (Gene Ontology enrichment analysis) генов, метилированных только в малигнантных или немалигнантных клетках. Показано, что аберрантное метилирование в малигнантных клетках затрагивает в первую очередь гены, участвующие в процессах развития организма и клеточной дифференцировки.
- Полученные данные в целом хорошо соответствуют современным представлениям о метаболических различиях между малигнантными и нормальными клетками.
Научно-технический уровень работ проекта соответствует мировым достижениям в области эпигенетики.