Регистрация / Вход
Прислать материал

Создание рекомбинантного штамма-продуцента новой MD-эндонуклеазы из энтеробактерий для использования в эпигенетике и онкодиагностике

Номер контракта: 14.576.21.0075

Руководитель: Чернухин Валерий Алексеевич

Должность: старший научный сотрудник ООО "СибЭнзайм"

Организация: Общество с ограниченной ответственностью "СибЭнзайм"
Организация докладчика: Общество с ограниченной ответственностью «СибЭнзайм»

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
рекомбинантный штамм-продуцент, клонирование генов, с5-метилированная днк, метилзависимая днк-эндонуклеаза (md-эндонуклеаза), пцр-скрининг, поиск гомологичных генов, сайт-специфичность, выделение ферментов, свойства днк-эндонуклеаз, эпигенетика, онкодиагностика.

Цель проекта:
1. Проблемы, на решение которых направлен реализуемый проект: Обнаруженные относительно недавно представители нового класса ДНК-эндонуклеаз – метилзависимые сайт-специфические ДНК-эндонуклеазы (MD-эндонуклеазы), отличаются от других сайт-специфических ДНК-эндонуклеаз тем, что они способны расщеплять лишь С5-метилированню ДНК. Такая специфическая особенность данных ферментов быстро привлекла внимание исследователей, поскольку эти ферменты оказались удобным инструментом для эпигенетических исследований, в том числе для разработки систем ранней онкодиагностики, для которых оказались важными такие выпускаемые в ООО «СибЭнзайм» MD-эндонуклеазы, как GlaI, BlsI и MteI. Новые ферменты оказались удобными и для эпигенетического картирования повторяющихся фрагментов геномных ДНК млекопитающих [Абдурашитов М.А., Чернухин В.А., Гончар Д.А., Дегтярев С.Х. GlaI digestion of mouse γ-satellite DNA: study of primary structure and ACGT sites methylation // BMC Genomics 2009, 10:322.]. Примечательно, что два из выпускаемых в ООО «СибЭнзайм» MD-эндонуклеазы – GlaI и BlsI – нашли применение во вновь разрабатываемых методах эпигенетического анализа, которые запатентованы в США [Molloy P.L., Rand K. Amplification of DNA fragments // US Patent No. 12/294,891; Wang H., Anisowicz A., Mastro R.D., Hui Huang, Mamaev S. Diagnosing human diseases by detecting DNA methylation changes // US Patent No. 11/634,755; FassbenderA., Lesche R., Distler J., Piepenbrock Ch., Rujan T., Berlin K., Koenig Th. Method for determining the methylation pattern of a polynucleic acid. // US Patent No. US 11/355,417.]. MD-эндонуклеазы, расщепляя те или иные отельные участки ДНК, позволяют проводить детальный анализ статуса метилирования как всего генома в целом, так и отдельных его небольших участков. При этом детализация такого рода анализа, возможности его широкого применения напрямую зависят от имеющейся ферментной базы. Для анализа того или иного участка генома важно иметь набор MD-эндонклеаз разной специфичности, что позволяет дискриминировать статус метилирования этих участков, а также типировать те или иные особенности метилирования, обусловленные тканеспецифичностью, онкологической трансформацией и другими эпигенетическими изменениями в клетках. Определение статуса метилирования отдельных небольших участков генома с помощью MD-эндонуклеаз обладает рядом преимуществ по сравнению с более традиционным методом бисульфитной конверсии (относительная дешевизна и меньшая трудоемкость; меньшая неоднозначность результатов). Однако в настоящее время используется небольшой набор ферментов, узнающих ограниченное количество метилированных последовательностей. Это связано, во-первых, с тем, что число описанных и коммерчески доступных MD-эндонуклеаз не превышает полутора десятков, причем большинство из них обнаружены в ООО «СибЭнзайм». Вторая причина, ограничивающая применение ферментов этого класса, – низкая активность большинства коммерчески доступных препаратов, которая в ряде случаев не позволяет получать полный 100% гидролиз метилированной ДНК. Широкое внедрение GlaI и BlsI в эпигенетику и онкодиагностику обусловлено высокой удельной активностью препаратов данных ферментов, которая отсутствует у всех остальных описанных MD-эндонуклеаз. Низкая активность ферментов оказывается критическим параметром, ограничивающим их применение, в частности, в ДНК-онкодиагностике, для проведения ПЦР-анализа требуется проводить полный гидролиз ДНК-матрицы, взятой из биологического образца (например, из крови пациента). Повышение активности препаратов ферментов возможно клонированием генов новых MD-эндонуклеаз в экспрессирующих векторах, что и было реализовано в рамках настоящего ПНИ. В ООО «СибЭнзайм» к началу выполнения данного ПНИ первое успешное клонирование MD-эндонуклеазы было осуществлено в 2014 году (все производимые до этого коммерческие препараты MD-эндонуклеаз были получены из диких штаммов). Был клонирован ген, кодирующий MteI . Его первичная последовательность легла в основу поиска отдалённых гомологов MD-эндонуклеаз в базах данных. При анализе геномных ДНК энтеробактерий было обнаружено, что нуклеотидные последовательности этих отдалённых гомологов высоко консервативны, что позволяет с помощью специально подобранных праймеров провести ПЦР-скрининг на геномных ДНК энтеробактерий из заранее собранной коллекции диких штаммов. Сама коллекция диких штаммов была собрана с помощью специальных селективных методов, в частности, с помощью использования среды Эндо. В рамках настоящего ПНИ была продемонстрирована возможность такого успешного поиска, а выделенный новый фермент ElmI пополнит ферментную базу для эпигенетики и молекулярной биологии. Таким образом, проект направлен на расширение как методологической базы для поиска и клонирования генов новых ферментов, так и связанной с этим поиском расширением ферментной базы для эпигенетики, в частности, онкодиагностики: новые метилзависимые сайт-специфические ДНК-эндонуклеазы (MD-эндонуклеазы), обладающие достаточно высокой активностью и новой специфичностью, быстро находят применения при создании методов диагностики предраковых состояний, что безусловно обеспечит более высокую эффективность предотвращения летальных исходов, связанных с онкологическими образованиями у людей. 2. Цели реализуемого проекта: 2.1 Поиск в коллекции природных штаммов энтеробактерий продуцента новой МD-эндонуклеазы, кодируемой геном, последовательность которого гомологична гену МD-эндонуклеазы MteI. 2.2 Создание методами биоинженерии рекомбинантного штамма-продуцента новой метилзависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазы (МD-эндонуклеазы), востребованной для использования в эпигенетике и онкодиагностике. 2.3 Исследование полученной генетической конструкции, технологических характеристик штамма-продуцента и специфичности продуцируемой рекомбинантной МD-эндонуклеазы.

Основные планируемые результаты проекта:
1. Краткое описание основных результатов:
1.1 Собранная коллекция штаммов энтеробактерий из разных природных зон и ландшафтов.
1.2 Новый подход, позволяющий выявлять и клонировать гены MD-эндонуклеаз из энтеробактерий.
1.3 Экспериментальный образец генетической конструкции для направленной модификации штаммов E.coli (рекомбинантной плазмиды).
1.4 Экспериментальный образец рекомбинантного штамма E.coli - продуцента новой МD-эндонуклеазы.
1.5 Экспериментальный образец препарата новой МD-эндонуклеазы, полученный из рекомбинантного штамма-продуцента E.coli.
1.6 Новый метод быстрого минипрепаративного выделения хромосомной ДНК из энтеробактерий.
1.7 Метод получения биомассы штамма-продуцента MD-эндонуклеазы.
1.8 Новый метод получения сайт-специфического гидролиза ДНК по сайтам, которые не расщепляются обычными эндонуклеазами рестрикции.
1.9 Установленные сайт-специфичность и биохимические свойства нового фермента.
1.10 Таксономическая идентификация дикого штамма-продуцента новой MD-эндонуклеазы и присвоение названия фермента согласно общепринятой номенклатуре.
1.11 Рекомендации и предложения по использованию новой МD-эндонуклеазы в медицине, эпигенетике (включая онкодиагностику), молекулярной биологии, генной инженерии и биотехнологии.

2. Основные характеристики планируемых результатов, научной (научно-технической, инновационной) продукции.

2.1 Экспериментальный образец генетической конструкции для направленной модификации штаммов E. coli должен отвечать следующим требованиям:
- содержать ген MD-эндонуклеазы с новой, не имеющей аналогов сайт-специфичностью;
- обеспечивать успешную трансформацию предварительно подобранного коммерчески доступного штамма Escherichia coli с получением штамма-продуцента новой MD-эндонуклеазы.
- трансформированный штамм E.coli должен проявлять активность новой MD-эндонуклеазы, которая может тестироваться в лизатах;
- объём препарата раствора плазмиды - не менее 1 мл;
- концентрация ДНК плазмиды в растворе – не менее 0,5 мкг/мкл;
- построенная физическая карта плазмиды должна обеспечивать быструю идентификацию плазмиды с помощью рестрикционного анализа.

2.2 Экспериментальный образец рекомбинантного штамма-продуцента E. coli должен обеспечивать следующие контролируемые технологические показатели эффективности:
- получение 1,5 – 2,5 г клеток c 1 л питательного бульона;
- содержание в 1 г клеток не менее 1000 единиц активности фермента;
- микробиологическая чистота урожая клеток не менее 99%;
- допустимая потеря активности биомассы не более 5% за 30 дней, при соблюдении условий хранения (-20 С);
- наличие гидролиза специальной С5-метилированной плазмидной ДНК после обработки лизатом, полученным из биомассы штамма-продуцента;
- отсутствие гидролиза неметилированной ДНК фага лямбда после обработки лизатом, полученным из биомассы штамма-продуцента.

2.3 Экспериментальный образец препарата рекомбинатной МD-эндонуклеазы должен удовлетворять следующим требованиям:
- МD-эндонуклеаза должна иметь новую, не описанную ранее сайт-специфичность;
- МD-эндонуклеаза должна гидролизовать только метилированную ДНК (и не гидролизовать не метилированную ДНК);
- МD-эндонуклеаза должна осуществлять только сайт-специфический гидролиз;
- объём препарата не менее 5 мл;
- удельная активность не менее 1000 е.а./мл;
- отсутствие гидролиза ДНК фага лямбда при добавлении препарата фермента в реакционном буфере;
- функциональная чистота: отсутствие активности примесных эндонуклеаз и фосфатаз на меченом P32 олигонуклеотидном дуплексе.

2.4 Новый метод минипрепаративного выделения геномной ДНК энтеробактерий должен обладать следующими показателями эффективности:
- обеспечивать получение 1-20 мкг геномной ДНК;
- время, необходимое для выполнения процедуры выделения ДНК, не должно превышать 2 часов.

2.5 Новый метод получения биомассы штамма-продуцента новой MD-эндонуклеазы должен обеспечивать выход биомассы с удельной активностью не менее не менее 1500 - 2500 единиц на 1 л культуральной жидкости.

2.6 Новый метод получения сайт-специфического гидролиза ДНК по сайтам, которые не расщепляются обычными эндонуклеазами рестрикции, должен обеспечивать получение 100% гидролиза ДНК по не менее, чем трём различным сайтам, которые не расщепляются сходным образом какой-либо из описанных в настоящее время эндонуклеаз рестрикции.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
1. Конечными продуктами, созданными с использованием результатов проведённого ПЦР-скрининга на геномных ДНК энтеробактерий, являются рекомбинантный штамм-продуцент новой метилзависимой сайт-специфической эндонуклеазы (MD-эндонуклеазы) и препарат фермента, выделяемый из него. Новый фермент позволяет детектировать эпигенетические изменения генома, проявляющиеся как определённый узор метилирования ДНК, что делает его важным инструментом в эпигенетике и онкодиагностике.
2. В работе разработаны новый способ для поиска и клонирования MD-эндонуклеаз, а также способ осуществления гидролиза С5-метиилированной ДНК. Новый фермент, полученный в ходе проекта, который получил название ElmI по совокупности свойств (сайт узнавания, узнаваемый узор метилирования, позиция гидролиза) не имеет аналогов.
3. Результаты, полученные в ходе выполнения ПНИ, соответствуют мировому уровню разработок в области молекулярной биологии и эпигенетики.
4. Поскольку главными результатами проекта являются генно-инженерный штамм-продуцент и выделяемый из него фермент с новой специфичностью, то основной риск недостижения этих результатов минимизирован разработкой новых дополнительных методов проведения работ, описанных выше.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
1. Области применения планируемых результатов: эпигенетика, ПЦР-диагностика, молекулярная биология, генная инженерия, биотехнология.
2. Практическое внедрение планируемых результатов или перспектив их использования.
Разработанный методический подход к поиску и клонированию генов новых MD-эндонуклеаз позволяет применять его не только для энтеробактерий, но и для любых семейств (и других таксономических групп) бактерий, первичная структура геномов которых имеется в базе данных.
В полученной рекомбинантной плазмиде определена первичная структура гена MD-эндонуклеазы, что
позволит не только производить встраивание этого гена в другие – потенциально более продуктивные векторы, но и позволит усовершенствовать биоинформационные подходы к выявлению генов других новых MD-эндонуклеаз.
Полученный рекомбинантный продуцент нового фермента позволит решить задачу производства коммерчески доступного препарата новой MD-эндонуклеазы ElmI, которая имеет большие перспективы применения в эпигенетическом анализе CG-метилированной ДНК человека.
Новый способ получения 100% гидролиза ДНК с помощью предварительного метилирования ДНК метилазами HaeIII и HspAI и последующим расщеплением её MD-эндонуклеазой ElmI открывает новые возможности использования разных метилаз и эндонуклеаз рестрикции в молекулярной биологии.
3. Полученные результаты по успешному проведение ПЦР-скрининга на геномных ДНК энтеробактерий дают основание для использования этого подхода в поиске и клонировании MD-эндонуклеаз и в других группах бактерий.
Запатентованный новый подход к сайт-специфическому гидролизу позволят существенно расширить возможности манипуляции с ДНК в генной инженерии и молекулярной биологии.
4. Результаты проекта окажут влияние на развитие рынка ДНК-метилтрансфераз. Это обусловлено необходимостью совместного использования новых MD-эндонуклеаз и модифицирующих ферментов.
Одним из направлений коммерциализации результатов проекта является постановка на производство препарата новой MD-эндонуклеазы ElmI, получаемой из нового рекомбинантного штамма. Данная коммерциализация возможна на производственном предприятии исполнителя проекта.
Продажи готового продукта предполагаются в двух целевых сегментах эпигеномного рынка: диагностические средства и продукция для научных исследований. Продажи нового фермента начнутся сразу после окончания данного проекта – со второй половины 2016 года. Планируемая товарная форма (фасовка препарата фермента с реакционным буфером и аналитическим паспортом). Ориентировочная цена ~7000 рублей. Предполагаемые объёмы продаж к 2020 году ~ 500 фасовок.

Текущие результаты проекта:
1. На основе проведённого поиска и анализа гомологов гена MD-эндонуклеазы MteI в имеющихся базах данных последовательностей ДНК был разработан новый методический подход, позволяющий выявлять и клонировать гены MD-эндонуклеаз из энтеробактерий.
2. Был разработан метод быстрого минипрепаративного выделения хромосомной ДНК из энтеробактерий, необходимый для успешного осуществления ПЦР-скрининга.
3. В результате применения нового методического подхода, а также метода быстрого минипрепаративного выделения ДНК в штаммах энтеробактерий, взятых из природных источников, был выявлен ген новой MD-эндонуклеазы, в результате клонирования которого методами генной инженерии был создан рекомбинантный штамм-продуцент.
4. На основе проведённых экспериментальных исследований, направленных на оптимизацию наработки биомассы целевого штамма и выделения целевого фермента было получено 2 экспериментальных образца – биомасса и препарат целевого фермента. На основе предварительно разработанных Программ и методик были проведены исследовательские испытания, которые показали, что полученные экспериментальные образцы удовлетворяют требованиям Технического задания.
5. На втором этапе работ установлено, что при выращивании нового штамма-продуцента, полученного в результате
трансформации штамма E.coli XL-Gold плазмидой pMTL_Esp17, индукция с помощью IPTG увеличивает суммарный выход фермента с единицы объёма культуральной жидкости в 4 раза.
6. Установлено, что наибольший выход функционально чистого препарата фермента даёт применение последовательных стадий хроматографической очистки на фосфоцеллюлозе Р11, фенилсефарозе и ДЭАЭ-целлюлозе. При использовании данной схемы из 10 г биомассы, выращенной в оптимальных условиях, получается ~ 3,5 мл функционально чистого препарата фермента с удельной активностью ~ 16-20 е.а./мкл.
7. Проведён анализ первичной структуры ПЦР-фрагмента (432 п.н.) участка генома энтеробактерии из рекомбинантной плазмиды. Установлена первичная структура гена, кодирующего новую MD-эндонуклеазу, и проведено сравнение с ближайшими гомологами. Наиболее близкими гомологами оказались рамки трансляции в штаммах Escherichia coli BL21 и С41: первичные аминокислотные последовательности в них отличаются на одну аминокислоту в позиции 26: аспарагину в BL21 и С41 соответствует аспарагиновая кислота в гене, кодирующем новую MD-эндонуклеазу.
8. Построена физическая карта плазмиды pMTL_Esp17 с указанием функциональных генов в ней и маркёрных сайтов рестрикции. Подтверждено совпадение результатов рестрикционного анализа с помощью маркёрных рестриктаз и теоретически предсказанной картины.
9. Проведён анализ сайт-специфичности полученной новой MD-эндонуклеазы. Показано, что она узнаёт и расщепляет последовательность 5’-RYNRY-3’ при С5-метилировании в ней не менее трёх цитозинов. Данный факт означает возможность применения фермента для эпигенетического анализа CG-метилированной ДНК человека. Ген фермента с данной специфичностью был клонирован впервые.
Показано, что при использовании в реакционной смеси 20% DMSO данный фермент эффективно (на 100%) расщепляет ту же последовательность 5’-RYNRY-3’ уже при С5-метилировании в ней не менее двух цитозинов.
10. Разработан метод получения сайт-специфического гидролиза ДНК по сайтам, которые не расщепляются обычными эндонуклеазами рестрикции: последовательностям: 5’-GCNGCNGC-3’, 5’-AGCTGCGC-3’; 5’-GGCCGCGC-3’; 5’-CGCGGCGC-3’.
11. Выбран наилучший лабораторный штамм E. coli (ER2267), обеспечивающий максимальную активность целевого фермента в биомассе.
12. Была проведена таксономическая идентификация дикого штамма-продуцента, из которого был амплифицирован и клонирован ген новой MD-эндонуклеазы. Дикий штамм был идентифицирован как Escherichia coli. Новой MD-эндонуклеазе было присвоено название согласно общепринятой номенклатуре ElmI.
13. Была проведена апробация полученного препарата ElmI на предмет использования в эпигенетике: были получены гидролиза геномных ДНК млекопитающих, включая человека. Было проведено ПЦР-тестирование статуса метилирования промоторных зон генов-онкосупрессоров в малигнантных клеточных линиях человека.
14. Разработан лабораторный регламент получения препарата МD-эндонуклеазы ElmI.
15. Разработан рекомендации и предложения по использованию результатов, полученных в ПНИ, в медицине, эпигенетике (включая онкодиагностику), молекулярной биологии, генной инженерии и биотехнологии.
16. Разработан аналитический паспорт препарата новой MD-эндонуклеазы ElmI.
17. Разработан паспорт рекомбинантного штамма-продуцента новой MD-эндонуклеазы ElmI согласно требованиям ВКПМ.
18. Осуществлено депонирование рекомбинантного штамма-продуцента новой MD-эндонуклеазы ElmI в ВКПМ.
19. Осуществлено патентование рекомбинантного штамма-продуцента ElmI.
20. Осуществлено патентование способа сайт-специфического гидролиза С5-метилированной ДНК по уникальным сайтам.
21. Разработан проект ТЗ на ОТР по теме: «Разработка технологии производства высокоочищенного препарата МD-эндонуклеазы, предназначенной для эпигенетики и медицинской ДНК-диагностики».
22. Разработан проект технических условий на товарную форму препарата МD-эндонуклеазы.