Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка технологии генной терапии раковых заболеваний человека на основе конъюгата псевдомонадного токсина с адресным белком.

Номер контракта: 14.576.21.0076

Руководитель: Ходарович Юрий Михайлович

Должность: научный сотрудник

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
генная терапия, иммунотоксин, псевдомонадный токсин, her2/neu

Цель проекта:
1. Задачей, на решение которой направлен данный проект, является совершенствование способов терапии рака, а также разработка новых эффективных противораковых препаратов. 2. Целью работы является создание генно-терапевтического продукта, пригодного для дальнейших испытаний в качестве препарата для лечения Her2/neu-положительных опухолей человека. Конечным продуктом, который может быть создан на основе результатов данного проекта, является набор генно-терапевтических препаратов и методик их применения для лечения широкого спектра онкологических заболеваний, включая Her2/neu-положительные опухоли.

Основные планируемые результаты проекта:
1. Основными результатами проекта должны стать генетические конструкции и методические указания по их применению для генной терапии Her2/neu-положительных опухолей. Генетические конструкции должны быть испытаны на панелях клеток на токсичность (наличие действия), а также на моделях in vivo (влияние на развитие опухоли). На основе результатов испытаний должны быть разработаны методические указания по генной терапии.
2. Эффект генной терапии должен обеспечиваться введением указанных генетических конструкций в опухолевые клетки в форме комплексов с выбранным трансфецирующим агентом и их внутриклеточной экспрессией. Конструкции кодируют укороченный вариант псевдомонадного токсина, даже в малой дозе блокирующего белковый синтез в поражённых клетках, и отличаются промотором (CAG / TERT) и наличием адресной функции у кодируемого белка, обеспечиваемой последовательностью лиганда рецептора Her2/neu. Планируется, что наличие адресной функции будет способствовать развитию т.н. "эффекта свидетеля" (bystander effect) - гибели интактных раковых клеток, окружающих трансфецированную. В результате работы должен быть получен такой комплекс, который обеспечивал бы гибель не менее 95% трансфецированных клеток, при частичной трансфекции культуры Her2/neu-положительных опухолевых клеток позволял бы достигнуть гибели 80% общего количества клеток, а также замедлял бы рост Her2/neu-положительных опухолей у мышей.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
1. Конечным продуктом, который может быть получен с использованием результатов проекта, является набор генно-терапевтических препаратов и методик их применения для лечения широкого спектра онкологических заболеваний, включая Her2/neu-положительные опухоли. Данный продукт позволит значительно продвинуться в развитии технологий эффективного лечения онкозаболеваний, прежде всего - лечения неоперабельных опухолей, и повысить выживаемость и качество жизни больных онкологическими заболеваниями.
2) Создание предлагаемых конструкций и их использование для генной терапии рака в современной научной литературе не выявлено. Описаны отдельные случаи разработки и испытания противораковых генно-терапевтических продуктов, кодирующих действующие агенты другого типа. Патентов, могущих помешать регистрации созданных конструкций, не выявлено.
3) Используемые подходы к достижению цели проекта, в том числе принципы создания генетических конструкций, кодирующих токсин, а также регулирующие его экспрессию, функционирование и локализацию элементы, и способы получения штаммов-продуцентов, соответствуют уровню лучших мировых разработок.
4) Для достижения заявленных результатов были разработаны генетические конструкции, содержащие последовательность укороченного варианта псевдомонадного токсина, вызывающего даже в малых дозах блокировку синтеза белка в клетке и, как следствие, её гибель. Варианты конструкции содержат различные промоторы, регулирующие интенсивность внутриклеточной экспрессии токсина, а также её тканеспецифичность. Некоторые варианты кодируют токсин, слитый с лигандом онкорецептора Her2/neu, что сделано для уничтожения раковых клеток, окружающих трансфецированную ("эффект свидетеля"). Для достижения достаточной эффективности трансфекции первичных клеток был произведён выбор трансфецирующего агента. Эффективность уничтожения трансфецированных клеток токсином доказывается на панелях клеток млекопитающих. Для проверки действия комплекса генетической конструкции и трансфецирующего агента на опухоль in vivo используется мышиная модель индуцированной опухоли, полученной с помощью инъекции клеток опухоли мышиной молочной железы D2F2/E2, несущих на себе человеческий рецептор Her2/neu. При отсутствии заметного влияния инъекции комплекса на динамику роста опухоли используется многократное введение комплекса.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
1. Основные области практического применения – разработка лекарственных средств и терапия онкологических заболеваний.
2. После завершения работ по проекту предполагается проведение предклинических испытаний созданного прототипа препарата. Перспективы его коммерциализации определяются эффективностью терапии с помощью созданного прототипа, а также законодательной возможностью применения генно-терапевтических препаратов в различных странах мира.
3. Разработка генно-инженерного препарата на основе псевдомонадного токсина, предназначенного для лечения Her2/neu-положительных опухолей человека, и убедительная демонстрация его эффективности могут послужить стимулом для исследований в области применения генно-инженерных конструкций, кодирующих те или иные токсины, для терапии различных заболеваний. В настоящее время эта область находится в начале своего развития. Успешные разработка, испытания и использование такого противоракового средства привлекут внимание учёных и медиков-онкологов к генно-инженерным препаратам, которые не имеют многих недостатков классических противораковых средств (в том числе препаратов на основе антител). Также получение эффективного прототипа препарата выведет Россию в ряд ведущих стран в области разработки генно-инженерных противораковых препаратов.
4. Успешная реализация проекта создаст предпосылки для развития международного сотрудничества с участием России в области генной терапии заболеваний, в частности - онкологических заболеваний. Полученные результаты представляют практическую ценность для ведущих коллективов мира, работающих в данной предметной области. Промежуточные результаты проекта были представлены на одной из ведущих технологических выставок мира. Планируется представление результатов проекта на конференциях (не менее 1 - международной) и их публикация в высокорейтинговых журналах (не менее 1 - международный).

Текущие результаты проекта:
В ходе выполнения проекта были разработаны три генетические конструкции (плазмиды) на основе гена укороченного варианта псевдомонадного токсина. Плазмида DC-ETA предназначена для достижения наибольшего эффекта от действия токсина в месте инъекции, в том числе - достижение максимально возможного «эффекта свидетеля» (bystaner effect). Плазмида DC-shETA является контрольной, т.к. токсин не секретируется и лишён адресной части, и необходима для изучения «эффекта свидетеля» при секреции токсина. Третья плазмида, TERT-ETA, отличается от DC-ETA заменой неспецифического CAG промотора на онкоспецифический промотор теломеразы человека hTERT, что должно значительно снизить её токсичность для нераковых клеток. Плазмиды наработаны с помощью бактериальных штаммов-продуцентов, доказаны соответствие их реальной структуры теоретической и чистота, достаточная для использования в генной терапии.
Исследовано действие плазмиды DC-ETA (CAG-ETA) на культуры клеток млекопитающих и опухоли мышей. Плазмида состоит из сильного синтетического CAG промотора, регулирующего экспрессию фрагмента псевдомонадного токсина, соединённого с молекулой DARPin, обладающей высокой аффинностью к рецептору HER2/neu. Трансфекция панели клеток приводит к резкому уменьшению количества жизнеспособных клеток, при этом для разных типов клеток требуется различное время для достижения эффекта. Тем не менее, в культуре всегда остаются интактные нетрансфецированные клетки, продолжающие делиться, и трансфецированные клетки не способны оказать на них заметный цитотоксический эффект («эффект свидетеля» не наблюдается).
Для исследования действия плазмиды in vivo была выбрана форма комплекса с трансфецирующим реагентом полиэтиленимином. Инъекции комплекса проводились в опухоли мышей, индуцированные с помощью линии клеток D2F2/E2, несущей человеческий рецептор Her2/neu. Однократные инъекции не оказывали значимого эффекта на рост опухолей. Трёхкратное же введение комплекса с интервалом 4-6 суток привело к существенному замедлению роста опухоли.