Регистрация / Вход
Прислать материал

Клонирование, выделение и изучение свойств новых бактериальных ДНК-метилтрансфераз M.AgsI, M.AluBI и M.FatI, узнающих и уникально модифицирующих последовательности ДНК TTSAA, AGCT и CATG, соответственно

Номер контракта: 14.576.21.0077

Руководитель: Дедков Владимир Сергеевич

Должность: старший научный сотрудник

Организация: Общество с ограниченной ответственностью "СибЭнзайм"
Организация докладчика: Общество с ограниченной ответственностью «СибЭнзайм»

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
днк-метилтрасфераза, днк-метилаза, система рестрикции-модицификации, сайт-специфичность, клонирование генов, штамм-продуцент, эпигенетика, днк-эндонуклеаза, консервативный мотив, чувствительность к метилированию днк, хроматографическая очистка белков.

Цель проекта:
Метилирование ДНК у животных и растений вовлечено в экспрессию генов, эмбриональное развитие, репарацию, дифференцировку клеток, защиту от вирусов, канцерогенез, старение. У бактерий метилирование ДНК связано с репликацией, рекомбинацией, репарацией а также с защитой от бактериофагов. Целями проекта являются: 1. Создание методами биоинженерии трех штаммов-суперпродуцентов новых бактериальных ДНК-метилтрансфераз - M.AgsI, M.AluBI и M.FatI, не имеющих аналогов, и востребованных для создания метилированных ДНК-субстратов в молекулярно-биологических исследованиях и современных технологиях эпигенетики. 2. Исследования полученных генетических конструкций, технологических характеристик штаммов-суперпродуцентов, получение и определение специфичности метилирования рекомбинантных ДНК–метилтрансфераз. Достижение целей проекта служит решению основополагающей задачи расширения ферментной базы для биологии и медицины. ДНК-метилтрансферазы проекта - M.AgsI, M.AluBI и M.FatI, не имеют аналогов и востребованы для создания метилированных ДНК-субстратов в молекулярно-биологических исследованиях и современных технологиях эпигенетики. В проекте предполагается провести исследования полученных генетических конструкций, технологических характеристик штаммов-суперпродуцентов, получить препараты новых ферментов и определить специфичность метилирования продуцируемых рекомбинантных ДНК–метилтрансфераз.

Основные планируемые результаты проекта:
- Создание в E. coli геномных библиотек Agrococcus species 25, Arthrobacter luteus B и Flavobacterium aquatile NL3 и выделение из них рекомбинантных плазмид, содержащих гены ДНК-метилтрансфераз M.AgsI, M.AluBI и M.FatI методом отбора плазмид, устойчивых к гидролизу сопряжёнными эндонуклеазами рестрикции (AgsI, AluBI и FatI).
- Получение рекомбинантных штаммов-продуцентов ДНК-метилтрансфераз M.AgsI, M.AluBI и M.FatI на основе отобранных рекомбинантных плазмид.
- Разработка технологии наработки биомассы рекомбинантных штаммов, и выделение из клеточных экстрактов препаратов ферментов путём последовательных хроматографий.
- Изучение значимых для практики биохимические свойства ДНК-метилтрансфераз M.AgsI, M.AluBI и M.FatI.
- Определение сайт-специфичности ферментов и типов метилирования оснований.
- Проведение анализа структур генов ДНК-метилтрансфераз M.AgsI, M.AluBI и M.FatI и кодируемых ими аминокислотных последовательностей.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
1. Создание экспериментальных образцов трех штаммов-суперпродуцентов новых прототипов бактериальных ДНК-метилтрансфераз - M.AgsI, M.AluBI и M.FatI, не имеющих аналогов, и востребованных для создания метилированных ДНК-субстратов в молекулярно-биологических исследованиях и современных технологиях эпигенетики.
Экспериментальные образцы должны отвечать следующим требованиям:
– должны быть пригодны для препаративной наработки биомасс рекомбинантных продуцентов;
– должны быть пригодны для выделения из биомасс препаратов ДНК-метилтрансфераз AgsI, AluBI и FatI;
– должны быть пригодны для измерения активности ДНК-метилтрансфераз M.AgsI, M.AluBI и M.FatI в пересчёте на 1 г клеток и на 1 л среды для сравнения с дикими продуцентами.
2. Экспериментальные образцы препаратов ДНК-метилтрансфераз AgsI, AluBI и FatI, получаемые из рекомбинантных штаммов E. coli, должны обеспечивать 100%-ное сайт-специфичное метилирование обеих цепей ДНК по сайту узнавания:
– 5’-TTSAA-3’ для ДНК-метилтрансферазы AgsI;
– 5’-CATG-3’ для ДНК-метилтрансферазы FatI;
– 5’-AGCT-3’ для ДНК-метилтрансферазы AluBI.
3. Исследования полученных генетических конструкций, технологических характеристик штаммов-суперпродуцентов, получение препаратов новых ферментов и определение специфичности метилирования продуцируемых рекомбинантных ДНК–метилтрансфераз.
4. Исследования чувствительности к метилированию большой выборки эндонуклеаз рестрикции, что имеет большой значение для практического использования этих ключевых для молекулярной биологии и генной инженерии ферментов.
Все получаемые ДНК-метилтрансферазы являются прототипами и не имеют аналогов.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Практическое применение ДНК-метилтрансфераз находится в области исследования процессов, связанных с тканевой дифференцировкой, онкологией и другими эпигенетическими изменениями. ДНК-метилтрансфераза FatI, метилирующая цитозин в положении С5, может служить инструментом для разработки систем онкодиагностики.
Метилирование геномной ДНК по тем или иным сайтам приводит к изменению картины сайт-специфического гидролиза ДНК-эндонуклеазами разных типов (эндонуклеаз рестрикции и метилзависимых ДНК-эндонуклеаз), а значит, может лежать в основе новых технологий эпигеномного секвенирования.
Конкурентным преимуществом новой ДНК-метилтрансферазы M.AgsI является то, что она модифицирует новую последовательность ДНК, не узнаваемую всеми ранее известными ДНК-метилтрансферазами.
ДНК-метилтрансферазы M.AluBI и M.FatI, хотя и узнают последовательности, узнаваемые другими ДНК-метилтрансферазами, модифицируют их по другим основаниям и других позициях.
Данные ферменты расширяют возможности для анализа чувствительности разных ДНК-эндонуклеаз, и таким образом, могут служить инструментом для модификации сайт-специфического гидролиза ДНК. В частности, совместное использование отдельных ДНК-метилтрансфераз, исследуемых в рамках проекта, приведёт к созданию новых способов сайт-специфического гидролиза с помощью метилзависимых ДНК-эндонуклеаз по новым последовательностям, которые нельзя расщепить более традиционными для практики эндонуклеазами рестрикции.
Возможность модификации ДНК такого рода с помощью новых ферментов также служит инструментом для изучения её роли в клетках (например, участие в процессах репликации бактериальных хромосом). Созданные штаммы-продуценты будут коммерциализованы в ООО «СибЭнзайм», специализированном биотехнологическом предприятии, г. Новосибирск.


Текущие результаты проекта:
- Клонированы гены ДНК-метилтрансфераз из Agrococcus species 25, Arthrobacter luteus B и Flavobacterium aquatile NL3 в E. coli RR1 в составе вектора pUC19. Продуцентов отбирали по устойчивости ДНК плазмид к сопряжённым эндонуклеазам.
- ДНК рекомбинантных плазмид были секвенированы и в них определены открытые рамки трансляции (ОРТ). По программе BLAST проведено выравнивание аминокислотных последовательностей и показано, что белки генов M.AgsI и M.AluBI относятся к аминометилтрансферазам, а белок M.FatI – к цитозин (C5)-ДНК-метилтрансферазам. M.AgsI, узнающая TTSAA, по-видимому, состоит из двух субъединиц. В настоящее время известны лишь три ДНК-метилтрансферазы М.AquI, М.EaeI, М.EcoHK31I, которые состоят из двух субъединиц. Все они относятся к классу цитозин (C5)-ДНК-метилтрансфераз. M.AgsI, таким образом, может являться первой субъединичной аденин-(N6)-ДНК-метилтрансферазой.
- Наработаны биомассы рекомбинантных продуцентов. Из них при помощи хроматографических процедур выделены препараты ДНК-метилтрансфераз, пригодные для молекулярно-генетических работ. По защите от сопряжённых эндонуклеаз определены оптимальные условия активности ферментов.
- Специфичность ДНК-метилтрансфераз была определелена путём мечения [3H]-SAM оснований в олигонуклеотидах, которые затем расщепляли по сайтам метилирования эндонуклеазами рестрикции IIs-типа. Также метилируемые основания были определелены путём блокирования активности эндонуклеаз рестрикции на ДНК фагов λ и Т7, метилированных M.AgsI, M.AluBI и M.FatI.
- Результаты анализа аминокислотных последовательностей, 3Н-мечения метилируемых оснований, тестирования метилированных сайтов эндонуклеазами рестрикции – показали, что M.AgsI образует 5'-TTSA(m6A)-3' на ДНК, M.AluBI – 5'-(m6A)GCT-3', M.FatI – 5'-(m5C)ATG-3'. Все три ДНК-метилтрансферазы обладают новой специфичностью и могут представлять интерес для молекулярно-генетических работ.
- ДНК фагов λ и Т7, метилированные M.AgsI, M.AluBI и M.FatI, использовали для определения специфичности ряда эндонуклеаз рестрикции, производимых в РФ, к новым видам метилирования. Полученные результаты расширяют возможности применения промышленных эндонуклеаз рестрикции для изучения метилирования ДНК.
Полученные рекомбинантные продуценты депонированы в ВКПМ. Поданы две заявки на изобретения и получены Уведомления ФИПС. Три статьи приняты Scopus-цитируемыми научными журналами.