Регистрация / Вход
Прислать материал

Бифункциональный рекомбинантный агент белковой природы на основе фрагмента псевдомонадного экзотоксина А для таргетной терапии HER2-положительных опухолей

Номер контракта: 14.578.21.0051

Руководитель: Деев Сергей Михайлович

Должность: заведующий лабораторией

Организация: федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И.Лобачевского"
Организация докладчика: федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Нижегородский государственный университет им. Н.И.Лобачевского"

Аннотация скачать
Постер скачать
Презентация скачать
Ключевые слова:
рекомбинантный белок; таргетная терапия; адресный противоопухолевый агент; онкомаркер her2; псевдомонадный экзотоксин а; цитотоксичность; ксенографтная опухоль человека

Цель проекта:
Реализуемый проект направлен на решение проблемы создания нового вида научно-технической импортозамещающей продукции с терапевтическим потенциалом. Практическими целями данного Проекта являются: (1) разработка и получение нового вида научно-технической импортозамещающей продукции с терапевтическим потенциалом, а именно, адресного бифункционального агента белковой природы «анти-HER2-токсин», предназначенного для селективной элиминации опухолевых клеток с повышенной экспрессией онкомаркера HER2; (2) оценка функциональной активности и терапевтического потенциала полученного адресного бифункционального агента «анти-HER2-токсин».

Основные планируемые результаты проекта:
В результате планируется разработать новый адресный бифункциональный агент, предназначенный для лечения рака молочной железы. Разрабатываемое соединение является аналогом импортных препаратов Герцептин® и Кадцила®. Аналогичные отечественные препараты не производятся, поэтому результаты решения задач проекта могут иметь высокое социальное и экономическое значение.
В результате выполнения Задач Проекта ожидается получение значимых научных результатов по разработке и внедрению нового вида научно-технической импортозамещающей продукции с терапевтическим потенциалом, а именно, адресных бифункциональных агентов белковой природы «анти-HER2-токсин», предназначенных для селективной элиминации опухолевых клеток с повышенной экспрессией онкомаркера HER2. Разработанный бифункциональный агент будет снабжен соответствующей научно-технической документацией и подготовлен для прохождения стадии доклинических испытаний. В результате технико-экономической оценки рыночного потенциала полученных результатов будут даны рекомендации и предложения по использованию результатов НИР в реальном секторе экономики, а также в дальнейших исследованиях и разработках. По итогам выполнения Проекта будет оформлено 2 патентные заявки. Будет опубликовано 6 статей в рецензируемых высокорейтинговых научных журналах.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
В результате выполнения Задач Проекта ожидается получение значимых научных результатов по разработке и внедрению нового вида научно-технической импортозамещающей продукции с терапевтическим потенциалом, а именно, адресных бифункциональных агентов белковой природы «анти-HER2-токсин», предназначенных для селективной элиминации опухолевых клеток с повышенной экспрессией онкомаркера HER2. Разработанный бифункциональный агент будет снабжен соответствующей научно-технической документацией и подготовлен для прохождения стадии доклинических испытаний. В результате технико-экономической оценки рыночного потенциала полученных результатов будут даны рекомендации и предложения по использованию результатов НИР в реальном секторе экономики, а также в дальнейших исследованиях и разработках. По итогам выполнения Проекта будет оформлено 2 патентные заявки. Будет опубликовано 6 статей в рецензируемых высокорейтинговых научных журналах.
Впервые в России будет использован перспективный подход для создания потенциальных адресных противоопухолевых бифункциональных агентов на основе новых рекомбинантных направляющих белковых модулей, специфичных к онкомаркеру HER2. Предварительное изучение научной и патентной литературы показало, что подобных соединений до сих пор не было создано. Планируется, что разработанный бифункциональный противоопухолевый агент «анти-HER2-токсин» будет способен к правовой охране.
В условиях высокого спроса на лекарственные препараты для лечения опухолей и большой конкуренции ведущих мировых фирм по их производству особенно актуальной является разработка инновационных отечественных терапевтических агентов, которые потенциально могут составить конкуренцию аналогичной импортной продукции, а также уменьшить финансовое бремя государства по обеспечению
граждан ЖНВЛП. Предлагаемый для разработки в настоящем Проекте бифункциональный противоопухолевый агент «анти-HER2-токсин» является аналогом импортных препаратов трастузумаб (Герцептин©) и трастузумаб-эмтанзин (Kadcyla©), так как воздействует на те же опухолевые клетки-мишени, что и указанные препараты. Однако в отличие от трастузумаба бифункциональный противоопухолевый агент «анти-HER2-токсин» должен обладать более выраженной избирательной цитотоксичностью, а в отличие от трастузумаб-эмтанзина является более биотехнологичным, а значит более дешевым соединением, поскольку представляет собой полностью рекомбинантный белок постоянного состава, не требующий посттрансляционных химических модификаций.
Новый высокоэффективный агент для таргентной терапии HER2-положительных опухолей, разрабатываемый в рамках данного Проекта, будет представлять собой бифункциональный рекомбинантный белок «анти-HER2-токсин», состоящий из адресного и токсичного модулей. В качестве адресного модуля, обеспечивающего доставку агента к опухолевым клеткам-мишеням с определенным молекулярным профилем и селективность воздействия на них, будут использованы:
1) одноцепочечные мини-антитела 4D5, специфически связывающиеся с онкомаркером HER2 и представляющие собой вариабельные домены антитела, лежащего в основе широко применяемого в медицинской практике
импортного противоопухолевого препарата Herceptin; 2) инновационный искусственно полученный каркасный полипептид DARPin, также способный избирательно связываться с онкомаркером HER2. В качестве альтернативы традиционно используемым для нацеливания на молекулярные мишени антителам DARPins обладают следующими преимуществами: 1) небольшим размером белка, что облегчает биохимические манипуляции с ним; 2) отсутствием цистеиновых остатков в
структуре и, как следствие, устойчивостью к агрегации и хорошей экспрессией; 3)термодинамической стабильностью. В качестве токсического модуля будет использован фрагмент псевдомонадного экзотоксина А, обеспечивающий элиминацию опухолевых клеток-мишеней, к которым доставляется разрабатываемый агент.
Псевдомонадный экзотоксин А является одним из самых высокотоксичных белковых токсинов, известных на сегодняшний день, на основе его создан целый ряд иммунотоксинов к различным мишеням, в том числе, находящихся на последних стадиях клинических испытаний, и использование в данной работе в качестве токсического модуля его фрагмента обеспечивает высокую вероятность получения агента, обладающего исключительной цитотоксической активностью. Два функциональных модуля в целевом агенте будут объединены в единый рекомбинантный белок методами генной инженерии. Такой подход к получению бифункциональных агентов, основанный на использовании полностью генетически кодируемых молекул полипептидной природы, обладает рядом
преимуществ в сравнении с часто используемой для этих целей химической конъюгацией, в первую очередь, постоянством состава и функциональных характеристик, что особенно важно для целей данного Проекта.
Получение бифункциональных анти-HER2-токсинов в бактериальных продуцентах позволит легко масштабировать технологию в лабораторном и промышленном производстве.
В результате выполнения проекта будет проведена оценка терапевтического потенциала создаваемого адресного бифункционального агента на культурах опухолевых клеток и ксенографтных опухолях человека, привитых мышам. Следует иметь в виду, что для дальнейшего внедрения в клиническую практику соединений, проявивших высокую эффективность на этих моделях, необходимо дальнейшее тщательное проведение доклинических и клинических испытаний.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Области применения полученных результатов: здравоохранение, фармацевтическая промышленность, наука и образование
Бифункциональный рекомбинантный агент белковой природы, который ожидается получить в результате выполнения Проекта, является потенциальным противоопухолевым терапевтическим агентом и после (и в случае) прохождения всех стадий доклинических и клинических испытаний может быть использован для лечения опухолей с определенным молекулярным профилем. Разработанные в ходе выполнения Проекта методики получения и количественной оценки функциональных свойств адресного агента белковой природы для терапии HER2-положительных опухолей могут быть использованы при создании подобных агентов другой специфичности и/или с другим токсическим модулем, а также для предварительного исследования функциональных характеристик аналогичных агентов для терапии HER2-положительных опухолей.
Возможными потребителями научно-технических результатов данного Проекта могут стать организации реального сектора экономики, специализирующиеся на разработке и внедрении фармацевтических субстанций для создания противоопухолевых лекарственных средств. Основной медицинской областью применения данной разработки должна стать адресная (таргетная) терапия онкологических заболеваний с определенным молекулярным профилем.
После успешного выполнения Проекта необходимо выполнение полноформатных доклинических исследований, весь объем которых можно провести на базе сертифицированной по принципам GMP лаборатории биологических испытаний Филиала ИБХ РАН. При получении положительных результатов следующим этапом станут клинические исследования. Весь основной объем этих исследований можно выполнить на базе ФГБУ "МНИОИ им. П.А. Герцена" Минздрава России и/ или ФГБУ Российский онкологический научный центр имени Н. Н. Блохина Российской академии медицинских наук.
Бифункциональный рекомбинантный агент белковой природы, который ожидается получить в результате выполнения Проекта, является потенциальным противоопухолевым терапевтическим агентом и после (и в случае) прохождения всех стадий доклинических и клинических испытаний может быть использован для лечения опухолей с определенным молекулярным профилем.
Возможными потребителями научно-технических результатов данного Проекта могут стать организации реального сектора экономики, специализирующиеся на разработке и внедрении фармацевтических субстанций для создания противоопухолевых лекарственных средств. Основной медицинской областью применения данной разработки должна стать адресная (таргетная) терапия онкологических заболеваний с определенным молекулярным профилем.
Разработанный в ходе выполнения проекта адресный бифункциональный агент будет являться продуктом новой технологии в области биоинженерии, а разработанные методики получения и количественной оценки функциональных свойств адресного агента белковой природы для терапии HER2-положительных опухолей могут быть использованы при создании подобных агентов другой специфичности и/или с другим токсическим модулем, а также для предварительного исследования функциональных характеристик аналогичных агентов для терапии HER2-положительных опухолей.
Результаты выполненных исследований будут включены в циклы лекций профессора С.М. Деева по новейшим методам биоинженерии в МГУ им. М.В. Ломоносова и ННГУ им. Н.И. Лобачевского.

Текущие результаты проекта:
В ходе выполнения Проекта в 2015 году (2 и 3 этапы работы) получены следующие результаты:
Получены четыре независимых экспериментальных образца анти-HER2-токсина
(образцы №1-4).
Разработана Программа и методики исследовательских испытаний экспериментальных образцов анти-HER2-токсина.
Проведены испытания четырех независимых экспериментальных образцов анти-HER2-токсина по физико-химическим и иммунохимическим свойствам в соответствии с Программой и методиками исследовательских испытаний, установившие полное соответствие методов получения и технических характеристик указанных образцов требованиям ТЗ.
Установлено, что наибольший выход белка составляет 157.5 мг/л культуры для экспериментального образца №2 (анти-HER2-токсин D29-PE40), полученного из растворимой внутриклеточной фракции лизатов клеток Escherichia coli BL21(DE3) [pET22-D29-PE40]. Выход белка для экспериментального образца №1, также полученного из растворимой внутриклеточной фракции, и экспериментальных образцов № 3 и №4, полученных из периплазматической фракции соответствующих продуцентов, значительно ниже и составляет 24.7, 15.2 и 37.5 мг/л культуры, соответственно.
Установлено, что экспериментальные образцы №1-4 представляют собой четыре независимых варианта анти-HER2-токсина, каждый из которых соответствует запланированной структуре белка, сохраняет стабильность в оптимальных условиях хранения в течение 3-х месяцев; по данным иммуноферментного конкурентного анализа специфично взаимодействуют с онкомаркером HER2 в интервалах концентраций 6.25-50 нМ (образцы №№1 и 3) и 2.9-22.5 нМ (образцы №№2 и 4).

Для иммуно-химической характеристики полученных анти-HER2-токсинов разработаны две методики исследования специфичности связывания вариантов анти-HER2-токсина с рецептором HER2. Разработанные методики количественной оценки связывания анти-HER2-токсина с рецептором HER2:
- основаны на взаимодействии анти-HER2-токсина с очищенным рекомбинантным фрагментом рецептора HER2, представляющего собой внеклеточный домен этого рецептора;
- обеспечивают определение константы связывания комплекса анти-HER2-токсина с внеклеточным доменом рецептора HER2 используют метод поверхностного плазмонного резонанса.
Для функциональной характеристики полученных анти-HER2-токсинов разработана методика исследования цитотоксического действия анти-HER2-токсина на культурах опухолевых клеток.
Подготовлена (подана) патентная заявка по результатам работы в рамках ПНИ.
Проведена валидация аналитических методик контроля качества экспериментальных образцов анти-HER2-токсина (за счет внебюджетных средств).
Проведены маркетинговые исследования, оценка рынка лекарственных препаратов белковой природы для адресной терапии HER2-положительных опухолей (за счет внебюджетных средств).
Впервые получены четыре принципиально новых рекомбинантных иммунотоксина, специфичных по отношению к клеткам, экспрессирующим онкомаркер HER2. Результаты исследования физико-химических и иммунохимических свойств иммунотоксинов свидетельствуют об их высокой чистоте, стабильности и специфичности связывания с маркером и позволяют перейти к испытаниям функциональных свойств иммунотоксинов на клеточных культурах.
Полученные результаты полностью соответствуют условиям Технического Задания и Плана-графика выполняемого проекта. Уровень научно-технического выполнения задач соответствует мировому.