Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка аналитической системы на основе суспензионных микрочипов для высокопроизводительного выявления биомаркеров онкозаболеваний.

Номер контракта: 14.578.21.0054

Руководитель: Набиев Игорь Руфаилович

Должность: Зав. лабораторией нано-биоинженерии

Организация: федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский ядерный университет "МИФИ"
Организация докладчика: Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Национальный исследовательский ядерный университет "МИФИ"

Аннотация скачать
Постер скачать
Презентация скачать
Ключевые слова:
аналитическая система; постгеномные технологии; ранняя диагностика рака; онкомаркеры; суспензионные микрочипы; рак шейки матки; рак молочной железы; рак яичников; квантовые точки.

Цель проекта:
1. Описание проблемы, обоснование актуальности ПНИ Одной из актуальных задач современной медицины является ранняя диагностика злокачественных новообразований, которые входят в перечень социально-значимых заболеваний человека, утвержденный Правительством РФ. Высокий общий уровень смертности, связанный с опухолевыми заболеваниями (1,7 млн. смертей в год в Западной Европе при пятом месте по смертности, занимаемом Российской Федерацией среди стран восточной и центральной Европы (www.cancerresearchuk.org/), во многом связан с недостаточным уровнем чувствительности существующих диагностических методов, ограничивающих возможность ранней детекции онкомаркеров. В настоящее время в РФ сохраняются высокие показатели летальности вызванной злокачественными новообразованиями. Так, по последним статистическим данным Министерства Здравоохранения РФ, в России от различных онкологических заболеваний в 2012 году умерло более 261 тыс. человек, при этом одногодичная летальность больных злокачественными новообразованиями составила 26.1%, а ежегодный прирост числа заболевших в среднем составляет 1.5%. Одним из важнейших критериев оценки диагностических возможностей современной онкологии является показатель запущенности, определяющий на какой стадии злокачественного новообразования был поставлен правильный диагноз, что определяет стретегию лечения и, в конечном итоге, показатели летальности. Статистичесие данные по Российской Федерации показывают, что значения показателя запущенности для некоторых нозологических форм злокачественных новообразований, в том числе для раков женской репродуктивной системы, остаются недопустимо высокими. Таким образом, значительный процент от всех случаев злокачественных новообразований детектируется на весьма запущенных, III и IV клинических стадиях, что осложняет эффективное лечения, ухудшает показатели летальности и увеличивает затраты на лечение. Недопустимо высокий удельный вес больных с запущенными стадиями опухолевого процесса во многом связаны с недостаточным уровнем чувствительности существующих диагностических методов, ограничивающих возможность ранней и высокопроизводительной дифференциальной диагностики злокачественных новообразований. 2. Цели выполнения ПНИ. 2.1 Создать аналитическую тест-систему на основе белковых биомаркеров для диагностики или типирования онкологических заболеваний. 2.2 Аналитико-диагностическая система будет создана на основе техники суспензионных микрочипов для высокопроизводительного, высокоточного и многопараметрического выявления биомаркеров рака молочной железы, яичников и шейки матки в сыворотке крови человека. 2.3 В качестве оптических меток суспензионных микрочипов, представляющих собой спектрально кодированные микросферы, несущие на себе распознающие молекулы, будут использованы флуоресцентные полупроводниковые нанокристаллы (НК), обладающие уникальными фотостабильностью и яркостью свечения, обеспечивающими минимум 10-кратное увеличение чувствительности диагностики, по сравнению с существующими аналогами, основанными на использовании органических флуорофоров. 2.4 Разрабатываемая аналитическая тест-система должна обеспечить одновременное экспрессное определение в пробе, объемом не более 10 мкл, не менее шести биомаркеров онкологических заболеваний. Данные анализа должны обеспечить диагностические точность, чувствительность и специфичность не менее 80%.

Основные планируемые результаты проекта:
1. Ожидаемые результаты.
В результате выполнения проекта будет создана аналитико-диагностическая тест-система для высокопроизводительного, высокоточного и многопараметрического выявления биомаркеров онкозаболеваний, обеспечивающая выполнение следующих задач:
- возможность одновременной многопараметрической и специфической детекции сразу нескольких антигенов – биомаркеров онкозаболеваний женской репродуктивной функции;
- возможность использования упрощенной системы оптической детекции сигналов за счет уникальных спектральных свойств НК.
Использование полупроводниковых НК для оптического кодирования обеспечивает повышенную чувствительность и практически неограниченные возможности тест-системы по количеству детектируемых параметров. Следовательно, достоверность анализа будет повышена за счет количественной детекции сразу нескольких онкомаркеров в одном образце сыворотки крови человека.
В целом, разработка оригинальна и не имеет аналогов в мире.
2. Возможность одновременного определения 6 информативных онкомаркеров для эффективной дифференциальной лабораторной диагностики доброкачественных и злокачественных патологий женской репродуктивной системы (опухоли молочной железы, опухоли яичников, рак шейки матки).
Предлагаемая система может быть эффективно внедрена в клиническую практику для систематического скрининга и своевременного дифференциального диагностирования различных форм нозологических форм заболеваний. Как показывают результаты экспертизы, проведенной специалистами Российского Онкологического Научного Центра (РОНЦ) им. Блохина, разрабатываемая в настоящем проекте аналитическая система будет способна эффективно заменить тест-системы, используемые в настоящее время в клинической практике. Ориентировочная потребность в таких тест-систем только для РОНЦ им. Блохина составит около 100 тысяч в год (письмо зам. директора РОНЦ им. Блохина, академика РАН М.Р. Личиницера, приложено), что позволяет оценить потребность в разрабатываемых системах в масштабах Российской Федерации как превышающую миллион экземпляров в год.
Также, нельзя не отметить, что предлагаемый проект соответствует направлениям стратегической программы исследований, осуществляемых технологической платформой "Медицина будущего".

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
1. Описание конечного продукта, создаваемого с использованием результатов, планируемых при выполнении проекта, места и роли проекта и его результатов в решении задачи/проблемы.
Конечный продукт настоящего проекта – аналитическая тест система для одновременной детекции 6 маркеров онкологических заболеваний женской репродуктивной системы в образце сыворотки крови человека. Аналитическая система представляет собой набор суспензионных чипов – полимерных микросфер, спектрально кодированных флуоресцентными нанокристаллами (квантовыми точками) различных цветов, с иммобилизованными на поверхности микросфер антителами, специфичными к белковым сыворотночным онкомаркерам.
Каждый спектральный код микросфер соответствует определенному типу распознающих молекул, иммобилизованных на поверхности микросфер. Анализ осуществляется по принципу иммуносэндвича: набор суспензионных микрочипов смешивают с сывороткой крови, при этом происходит специфическое связывание белковых маркеров с поверхностными распознающими молекулами микрочипов.
После отмывки несвязавшихся компонентов сыворотки к анализируемой суспензии микрочипов добавляют детекторные молекулы, связанные с референсной флуоресцентной меткой, при этом на поверхности микрочипов формируется иммунодиагностической комплекс, детекцию которого осуществляют методом проточной цитометрии. По соотношению флуоресцентных сигналов спектрального кода и референсной флуоресцентной метки рассчитывают концентрацию определенного онкомаркера в исходном образце сыворотки.
Результаты проекта позволят внести существенный вклад в решение проблемы разработки новых методов высокочувствительной многопараметрической детекции маркеров онкологических заболеваний.

2. Оценка элементов новизны научных (технологических) решений, применявшихся методик.
В работе применяются уникальные методики синтеза и солюбилизации флуоресцентных нанокристаллов, получения микросфер, спектрально кодированных флуоресцентными нанокристаллами.
Подается заявка на получение патента, что подтверждает уникальность разработанной технологии.

3. Сопоставление с результатами аналогичных работ, определяющими мировой уровень.
В мире ведутся разработки по создаю суспензионных систем на основе органических флуоресцентных красителей и флуоресцентных нанокристаллов. Основной недостаток работ с использованием флуоресцентных красителей – невозможность одновременного возбуждения нескольких типов красителей одним источником возбуждающего излучения. Для использования систем с большим количеством спектральных кодов необходимо сложное оборудование (проточный цитометр) с несколькими возбуждающими лазерами и сложная система идентификации кодов.
Системы на основе флуоресцентных нанокристаллов, за счет их уникальных спектральных свойств, позволяют использовать один источник возбуждения, что упрощает и удешевляет конструкцию используемого оборудования. Однако, в большинстве работ авторы сталкиваются с проблемой резонансного переноса излучения, а также перепоглощения между нанокристаллами разных цветов, что приводит к искажению спектрального кода. Уникальность наших разработок заключается в создании спектрально кодированных микросфер с многослойной структурой, что позволяет существенно снизить вероятность явлений переноса между нанокристаллами различных цветов.
Одновременная детекция нескольких онкомаркеров представляет собой отдельную задачу, которая решается тонким подбором условий, оптимальных для одновременной сборки нескольких типов иммунодиагностических комплексов в объеме одного образца. Ранее нами была опубликована работа по одновременной детекции 2 онкомаркеров (двух типов простатического специфического антигена) с помощью суспензионной системы, содержащей всего два типа суспензионных микрочипов. Однако, одновременная детекция 6 маркеров является более комплексной задачей, требующей учета различных факторов сложной многокомпонентной системы: различия в константах связывания антител и антигенов различных типов, возможность перекрестной активности антител, различная стерическая доступность антител на поверхности микрочипов и др.

4. Пути и способы достижения заявленных результатов, ограничения и риски.
В процессе разработки заявленной тест системы были разработаны способы получения солюбилизированных нанокристаллов, отработана методика получения спектрально кодированных микросфер, подобраны условия иммобилизации распознающих молекул (однодоменных антител, моноклональных антител и их активных фрагментов) на поверхности микросфер, подобраны рабочие пары распознающих и детекторных молекул. Ограничения по одновременной детекции 6 маркеров могут связаны со специфическими свойствами антител и антигенов, что требует трудоемкого подбора специфических условий для одновременной и независимой сборки 6 иммунодиагностических комплексов в малом объеме клинического образца.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
1. Описание областей применения планируемых результатов (области науки и техники, отрасли промышленности и социальной сферы, в которых могут использоваться результат или планируемая на их основе инновационная продукция).
Области применения разрабатываемой аналитической тест-системы: клиническая лабораторная практика, научные исследования, разработка методов многопараметрической детекции большого спектра биологических маркеров онкологических и других социально-значимых заболеваний.

2. Описание практического внедрения планируемых результатов или перспектив их использования.
Основным преимуществом разрабатываемой аналитической тест-системы является возможность упрощения и ускорения процедуры анализа, уменьшения количества биологического материала, необходимого для исследования и снижение стоимости диагностики.
Практическое внедрение результатов планируется в сотрудничестве с индустриальным партнером проекта, ООО Наномультиплекс.

3. Оценка или прогноз влияния планируемых результатов на развитие научно-технических и технологических направлений, разработку новых технических решений; на изменение структуры производства и потребления товаров и услуг в соответствующих секторах рынка и социальной сферы.
Разрабатываемая система является альтернативой методу иммуноферментного анализа, широко используемому в клинической лабораторной практике. Успешная валидация создаваемой аналитической системы позволит использовать разрабатываемый подход для детекции большого спектра биологических маркеров (как белковых маркеров, так и специфических антител).

4. Оценка или прогноз влияния планируемых результатов на развитие исследований в рамках международного сотрудничества, развитие системы демонстрации и популяризации науки, обеспечение развития материально-технической и информационной инфраструктуры.
Работа над проектом ведется в сотрудничестве с Реймским Университетом Шампань-Арденн (Франция) и в рамках Европейской технологической платформы "Полупроводниковые нанокристаллы", с использованием Европейских инфраструктурных объектов, уникальных научных установок и центра коллективного пользования.

Текущие результаты проекта:
Основные экспериментальные результаты, полученные с начала выполнения проекта:
1. Синтезированы и получены стабильные водорастворимые флуоресцентные нанокристаллы различных цветов.
2. Получена панель спектрально кодированных микросфер различного размера и с разными химическими свойствами поверхности, содержащих в своем составе нанокристаллы одного или нескольких цветов. Проведены эксперименты по оценке оптической и коллоидной стабильности микросфер в различных экспериментальных условиях.
3. Получены различные распознающие и детекторные молекулы (однодоменные антитела, моноклональные антитела и их активные фрагменты, специфичные к онкомаркерам), разработаны условия иммобилизации распознающих молекул на поверхности микросфер, подобраны рабочие пары распознающих и детекторных молекул.
4. Изготовлены экспериментальные образцы аналитической тест-системы и проведены испытания образцов на примерах детекции индивидуальных биомаркеров онкологических заболеваний. Подобраны оптимальные условия для построения калибровочных зависимостей и детекции индивидуальных маркеров в клинических образцах сыворотки крови человека. Проведена оценка характеристик аналитической тест-системы.
5. Полностью собрана коллекция образцов сыворотки крови пациентов со злокачественными и доброкачественными заболеваниями женской репродуктивной системы, а также здоровых доноров.

Коллективом исполнителей со средним возрастом в 35 лет опубликовано, на конец 2015 г., пять работ в изданиях, цитируемых в базах данных Scopus или Web-of-Science, подготовлен один патент, принято участие в трех мероприятиях по демонстрации и популяризации результатов проекта, защищена одна диссертация.
Коллективом привлечено 19,59 млн. руб. внебюджетных средств, использовано в работе две уникальные научные установки, а также два центра коллективного пользования НИЯУ МИФИ.