Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка оптических методов исследования функционирования мозга в норме и патологии

Номер контракта: 14.578.21.0079

Руководитель: Семьянов Алексей Васильевич

Должность руководителя: Профессор

Докладчик: Доронин Максим Сергеевич, аспирант

Организация: федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И.Лобачевского"
Организация докладчика: Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Нижегородский государственный университет им. Н.И.Лобачевского"

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:

Цель проекта:
1. Самостоятельная сборка двухфотонной системы позволит существенного увеличить скорость и качество получения экспериментальных результатов исследований мозга в нормальных и патологических условиях, а также расширить диапазон применяемых методов и снизить затраты. 2. Цель - разработка оптических методов в области нейробиологии для исследования функционирования мозга в норме и патологии.

Основные планируемые результаты проекта:
1. Для достижения поставленной цели были или будут получены следующие основные результаты:

1.1. Аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы; патентные исследования.
1.2. Разработка технических принципов оптической системы высокого разрешения.
1.3. Разработка метода построения построения оптического пути для системы микроскопии.
1.4. Разработка математических алгоритмов управления оптической системы микроскопии.
1.5. Разработка программы ЭВМ для анализа экспериментальных данных.
1.6. Разработка протокола совмещения в одной фокальной плоскости стимулирующего и сканирующего лазеров.
1.7. Разработка оптической системы, включающая в себя два лазера и высокоскоростной резонансный сканер.
1.8. Разработка программного обеспечения для управления гальванометрическим и резонансным сканерами, направляющими лучи сканирующего и стимулирующего лазеров.
1.9. Разработка протокола оптической стимуляции in vivo и in vitro с использованием животных с оптогенетическими маркерами.
1.10. Разработка технических требований и предложений по разработке, производству и эксплуатации продукции с учётом технологических возможностей и особенностей индустриального партнёра - организации реального сектора экономики.
1.11. Проведение экспериментальных исследований оптической системы на лабораторных образцах.
1.12. Разработка проекта технического задания на проведение ОКР по теме: "Разработка оптических методов исследования функционирования мозга в норме и патологии

2. Основные характеристики планируемых результатов и научно-технической продукции:
2.1. Основным требованием к техническим характеристикам разрабатываемой оптической системы является высокая скорость сканирования не менее 50 Гц за счёт использования резонансного сканера.
2.2. Требуется достаточная мощность стимулирующего лазера для фотостимуляции не менее 3,5Вт.
2.3. Программное обеспечение для управления резонансным сканером должно обеспечивать скоростную работу для реконструкции изображений в режиме реального времени, т.е. должно позволять получение сигнала с частотой не менее 25 Гц.
2.4. Разработка собственного программного обеспечения в среде программирования LabVeiw или Matlab.
2.5. Система должна обладать высоким разрешением (латеральное 290 нм, аксиальное 500 нм) и способностью проникать на большую глубину (0,6-1 мм).

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
1. Создание собственной двухфотонной системы позволит снизить затраты и увеличить качество методов получаемых данных. Также это позволит увеличить скорость исследований мозга в норме и при патологиях, что является важным условием при исследовании нейрональных сетей во всем многообразии их строения и функционирования.
В ходе реализации проекта «Разработка оптических методов исследования функционирования мозга в норме и патологии» планируется самостоятельно построить двухфотонную систему лазерной сканирующей микроскопии с двумя сканирующими модулями, а также двумя фемтосекундными импульсными инфракрасными лазерами для сканирования и фотостимуляции исследуемых объектов. Создание некоммерческой двухфотонной системы на базе имеющихся в коммерческом доступе оптических модулей и частей приведёт к созданию высокоскоростной и низкозатратной оптической системы, способной сочетать высокое качество получаемых экспериментальных данных с малым уровнем инвазивности.

2. Данная оптическая система может найти широкое применение в сфере разработки и тестирования фармакологических препаратов, в фундаментальных исследованиях головного мозга в нормальных и патологических состояниях, а также в некоторых физических исследованиях, требующих высокой скорости получения данных в сочетании с большим разрешением микроскопа.

3. В мировой практике развитие оптических методов стимуляции и двухфотонной микроскопии необходимо для изучения функционирования нейрональных сетей, ключевых факторов взаимодействия нейронов [1], таких как передача нервных импульсов и синаптическая пластичность [2], кальциевой динамики нейронов и астроцитов с использованием генетически закодированных индикаторов in vitro и in vivo [3] и оптогенетических методов для манипуляции нейрональной активностью [4-6], для изучения регуляции долговременной потенциации при различных нарушениях [7].
Важным звеном проведения комплексного изучения мозга является разработка оптических методов регистрации получаемых сигналов, в частности, двухфотонной микроскопии. Двухфотонная микроскопия обладает рядом преимуществ по сравнению с другими видами микроскопии и позволяет проводить исследования на живых тканях с меньшим её повреждением, при этом обладая более высоким разрешением (латеральное 290 нм, аксиальное 500 нм), способностью проникать на большую глубину (0,6-1 мм) и меньшей функцией рассеивания. С помощью этого метода проводятся исследования на дендритных шипиках (диаметр 0,5-1 мкм) и астроцитарных отростках [8].

4. Одним из подходов для улучшения качества является оптимизация оптической схемы и элементов микроскопа. Однако данный подход очень ресурсозатратный, поскольку коммерчески доступные системы не производятся в России, что сильно повышает стоимость готовых к использованию систем. В таких условиях решением может быть создание собственной системы двухфотонной лазерной сканирующей микроскопии, которая в дельнейшем может быть выведена на рынок. Кроме того, создание такой системы позволит улучшить свойства микроскопа под определённые типы исследований для решения конкретных научных задач при значительной более низкой стоимости итоговой системы. В самостоятельно изготовленной системе исследователь имеет возможность выбора того или иного набора функций и методов, которыми будет обладать микроскоп. В частности, сканирующие модули возможно изготовить с использованием зеркальных гальванометров, резонансных гальванометров, акусто-оптических модуляторов и так далее. Каждое из таких решений может быть оправдано той или иной научной задачей, решением которой занимается исследовательская группа. Ведущие мировые лаборатории уже показали эффективность и надёжность применения самостоятельно созданных систем микроскопии. Использование таких микроскопов позволяет не только увеличить качество, скорость исследования мозга в тех или иных условиях, но и увеличить эффективность исследований за счёт полностью самостоятельного обслуживания системы. В ходе реализации проекта «Разработка оптических методов исследования функционирования мозга в норме и патологии» планируется самостоятельно построить двухфотонную систему лазерной сканирующей микроскопии. Отличительной особенностью данной системы является наличие двух сканирующих модулей, один из которых планируется использовать для реализации быстрого сканирования, а также двух фемтосекундных импульсных инфракрасных лазеров для сканирования и фотостимуляции.
Также предполагается, что построенный в рамках реализации проекта «Разработка оптических методов исследования функционирования мозга в норме и патологии» микроскоп станет уникальным микроскопом, построенным на территории Российской Федерации. Научная группа планирует не только спроектировать и создать микроскоп, но и проводить на нём научные исследования. Планируется совмещение нескольких методик на базе указанной системы. Такая апробация системы в реальных экспериментах позволит выявить те или иные недостатки микроскопа, которые будут устранены. Соответственно, проверенный в работе микроскоп впоследствии может быть выведен на российский рынок как самостоятельная исследовательская система. Это позволит микроскопу иметь высокие характеристики за счёт использования высококачественных комплектующих, а также иметь низкую стоимость (по сравнению с зарубежными аналогами). Данный проект является уникальным в своём роде, поскольку предполагается реальный шаг в сторону импортозамещения в области научного оборудования, которое в настоящее время практически полностью импортируется.

Используемые источники:
1. Stosiek C, Garaschuk O, Holthoff K, Konnerth A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks // Proc Natl Acad Sci U S A., 2003. –Vol. 100(12). – P. 7319-7324.
2. Jia H, Rochefort NL, Chen X, Konnerth A. In vivo two-photon imaging of sensory-evoked dendritic calcium signals in cortical neurons // Nat Protoc., 2011. – Vol. 6(1). – P. 28-35.
3. Rochefort NL, Konnerth A. Genetically encoded Ca2+ sensors come of age // Nat Methods. 2008 Sep; 5(9):761-2. doi: 10.1038/nmeth0908-761. No abstract available.
4. Deisseroth K. Optogenetics // Nat Methods, 2011- Vol. 8(1). P.26-29.
5. Liu X, Tonegawa S. Optogenetics 3.0 // Cell, 2010. – Vol. 141(1). – P. 22-24.
6. Nagode DA, Tang AH, Karson MA, Klugmann M, Alger BE.Optogenetic release of ACh induces rhythmic bursts of perisomatic IPSCs in hippocampus // PLoS One, 2011. Vol. 6(11).
7. Nabavi S, Fox R, Proulx CD, Lin JY, Tsien RY, Malinow R. Engineering a memory with LTD and LTP // Nature, 2014. -Vol. 511(7509). -P.348-352.
8. Cole RW, Jinadasa T, Brown CM. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control // Nat Protoc., 2011. – Vol. 10; 6(12). – P. 1929-1941.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
1. Разработка оптических методов исследования функционирования мозга в норме и патологии может быть использовано для разработки современных методов лечения различных нейродегенеративных заболеваний. Например, для предотвращения развития эпилепсии имеется возможность использования оптогенетики и оптических методов визуализации. Работа с указанными методами требует не только наличия высокотехнологического оборудования, но знания и умения применить сложные математические алгоритмы для анализа и обработки данных, которые необходимы для корректной интерпретации получившихся результатов.

2. Научная группа планирует не только спроектировать и создать микроскоп, но и проводить на нём научные исследования. Таким образом, проверенный в работе микроскоп впоследствии может быть выведен на российский рынок как самостоятельная исследовательская система. Важно отметить, что создание некоммерческой двухфотонной системы на базе имеющихся в коммерческом доступе оптических модулей и частей приведёт к созданию высокоскоростной и низкозатратной оптической системы. Такая система будет способна сочетать высокое качество получаемых экспериментальных данных с малым уровнем инвазивности, что позволит увеличить скорость исследований мозга в норме и при патологиях. Такие исследования являются важными для изучения функционирования и строения нейрональных сетей. Собственная двухфотонная система позволит проводить фундаментальные исследования функционирования мозга, а также разрабатывать и тестировать фармакологические препараты, проводить физические исследования. Создание такой системы позволит не только выполнять научные задачи коллектива Нейронаучного центра ННГУ им. Н.И. Лобачевского, но и может быть востребовано другими научными центрами на территории Российской Федерации и за рубежом.

3. Данные результаты будут применимы для тестирования действия медицинских препаратов на различных уровнях организации от молекулярного до организменного, позволят точно и высокоэффективно идентифицировать конкретные клеточные механизмы и пути деградации того или иного препарата. Разработанная оптическая система позволит также проводить более фундаментальные исследования нейрон-глиального взаимодействия и функционирования нервной системы в целом как в норме, так и при патологии с использованием оптогенетических методов. Позволит идентифицировать ранние изменения в функционировании нервной системы при развитии нейродегенеративных заболеваний.

4. Возможными потребителями результатов данной ПНИЭР могут быть фармацевтические компании, заинтересованные в быстром и эффективном тестировании препаратов. Потребителями могут стать все крупнейшие российские фармацевтические компании, такие как Фармстандарт, BIOCAD, Акрихин-фарма, Биотек-Волга, Герофарм, Европлант. Разрабатываемые алгоритмы усовершенствования оптических сигналов могут быть применимы другими лабораториями в России в области биологии и физики для проведения более сложных и точных исследований. Описанная методика создания двухфотонных систем позволит другим лабораториям и научно-исследовательским институтам создавать собственные системы, при этом снижая расходы и улучшая качество исследований. В первую очередь это будут научно-исследовательские институты, находящиеся в сотрудничестве с Нижегородским нейронаучным центром Института биологии и биомедицины ННГУ, такие как ИПФ РАН (Нижний Новгород), НижГМА (Нижний Новгород), Казанский Федеральный Университет (Казань), Институт нормальной физиологии им. П.К.Анохина РАМН (Москва), Институт высшей нервной деятельности РАН (Москва), а также зарубежные партнеры Deutsches Zentrum für Neurodegenerative Erkrankungen (DZNE) (Магдебург, Германия), Faculty of Life Sciences, The University of Manchester (Манчестер, Великобритания).

Текущие результаты проекта:
Выполнен аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей научно-техническую проблему, исследуемую в рамках ПНИЭР. Проведены выбор и обоснование направления исследований. Проведены патентные исследования и разработаны технические принципы оптической системы.
В результате выполнения работ были изучены принципы современных оптических систем высокого разрешения на примере методов конфокальной микроскопии и её модификаций, мультифотонной микроскопии и систем сверхвысокого разрешения (STED, STORM, PALM). Кроме того, исследованы основные принципы оптогенетических технологий и генетически-закодированных маркеров, применимых в оптических системах сверхвысокого разрешения. Разработаны технические принципы оптической системы собственного производства с учётом особенностей существующих моделей, их свойств и характеристик комплектующих.

Выполнен анализ современной научно-технической и методической литературы, позволяющий более детально изучить вопросы по построению системы микроскопии. Проведено компьютерное моделирование разрабатываемой схемы системы микроскопии высокого разрешения при помощи программного обеспечения «Компас». Разработан оптический путь системы микроскопии для реализации работы дифференциального интерференционного контраста, гальванометрического и резонансного сканеров, а также принцип работы, компоновки и построения двигающейся платформы с объективами и детекторами флуоресцентного сигнала слабой интенсивности. Разработаны математические алгоритмы управления оптической системы. Создана программа ЭВМ для анализа экспериментальных данных на базе пакета программирования Matlab.
В результате выполнения работ разработана схема системы микроскопии с использованием программного обеспечения «Компас». Так, создана схемы П-образной стойки для микроскопа с креплениями к антивибрационному столу, а также источником света для ДИК и частями оптических путей для использования гальванометрического и резонансного сканеров. Кроме того, разработано три вида оптического пути для реализации работы дифференциального интерференционного контраста для визуализации тканей мозга в экспериментах in vitro, а также для реализации работы гальванометрического и резонансного сканеров для проведения имиджинговых экспериментов in vitro и in vivo, а также проведения фотостимуляции (точечный анкейджинг). Также разработан принцип работы двигающейся платформы, к которой закреплены объективы, а также так называемые non-descanned detectors и система фильтров для регистрации флуоресцентного сигнала низкой интенсивности разных длин волн. Создан протокол совмещения в одной фокальной плоскости стимулирующего и сканирующего двухфотонных лазеров при помощи «грубого» и «точного» вариантов. Создана программа для проведения морфометрического анализа клеточных структур, таких как морфологические параметры дендритных шипиков пирамидных СА1 нейронов.

В настоящее время в соответствии с планом-графиком проводятся разработка программного обеспечения для управления гальванометрическим и резонансным сканерами, направляющими лучи сканирующего и стимулирующего лазеров; разработка оптической системы, включающая в себя два лазера и высокоскоростной резонансный сканер; разработка протокола генотипирования трансгенных животных методом полимеразной цепной реакции.