Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка технологии получения новых биосовместимых, биодеградируемых гидрогелевых изделий медицинского назначения на основе рекомбинантных белков паутины

Номер контракта: 14.579.21.0017

Руководитель: Дебабов Владимир Георгиевич

Должность: научный руководитель института

Организация: федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт"
Организация докладчика: Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов"

Аннотация скачать
Постер скачать
Презентация скачать
Ключевые слова:
рекомбинантные спидроины, биорезорбируемые гидрогели и микрогели, лабораторный регламент, опытно- промышленный регламент, программа и методики испытаний, экспериментальные образцы, выделение и очистка доклинические испытания, масштабирование, раны, покровный материал

Цель проекта:
Проблема: производство имплантатов и продукции для восстановительной и заместительной медицины сдерживается недостаточным предложением имплантируемых материалов и изделий с необходимым комплексом медико-технических свойств. Известные разрабатываемые и применяемые раневые покрытия имеют ряд недостатков, связанных или с их недостаточной прочностью, или с неприемлемым временем резорбции, или негарантированной биосовместимостью, что отрицательно влияет на их биологическую безопасность, увеличивает вероятность образования рубцовых тканей и опухолей, сдерживая их широкое применение в клинической практике. Цель проекта: разработка технологии получения новых биосовместимых, биодеградируемых гидрогелевых изделий на основе рекомбинантного белка паутины для использования в качестве материала для регенеративной медицины и, в том числе, для лечения ран и ожогов. В результате планируется разработать промышленную технологию получения микробным синтезом рекомбинантного белка паутины (рекомбинантного спидроина) и биорезорбируемых гидрогеля и микрогеля на его основе и провести их доклинические испытания.

Основные планируемые результаты проекта:
1. Должны быть получены следующие результаты и научно-техническая продукция:
- результаты патентных исследований в соответствии с ГОСТ Р 15.011-96;
- протоколы получения экспериментальных образцов рекомбинантного спидроина, гидрогелей и микрогелей на его основе и их физико-химических, технологических и медико-биологических
испытаний;
- лабораторные регламенты получения микробным синтезом рекомбинантного спидроина, гидрогелей и микрогелей на его основе;
- экспериментальные образцы рекомбинантного спидроина, гидрогелей и микрогелей на его основе;
- программа и методики исследовательских и доводочных испытаний технологических процессов в соответствии с ЛР и экспериментальных образцов разрабатываемой продукции;
- проекты нормативной документации (ТУ на рекомбинантный белок, гидрогели и микрогели на его основе);
- регистрационное досье на изделия медицинского назначения в виде гидрогеля и микрогеля на основе рекомбинантного спидроина для представления в МЗ РФ;
- проект ОПР получения субстанции рекомбинатного спидроина, гидрогеля и микрогеля;
- предложения и рекомендации по реализации (коммерциализации) результатов ПНИ, вовлечению их в хозяйственный оборот;
- проект ТЗ на ОТР «Разработка опытно-промышленной технологии получения субстанции рекомбинатного спидроина, гидрогеля и микрогеля на его основе»;
- 2 патентные заявки, поданные по результатам исследований и разработок.
2. Основные характеристики планируемых результатов и продукции:
Создаваемые в рамках проекта новые изделия медицинского назначения на основе рекомбинантного спидроина должны быть предназначены для использования их в качестве покровного материала для лечения ран и ожогов.
Модификация штамма-продуцента рекомбинантного спидроина должна повысить выход чистого рекомбинантного спидроина на 13%.
Усовершенствование процесса культивирования штамма-продуцента рекомбинантного спидроина при ферментации в 30-литровом ферментере должно давать не менее 150 г влажной биомассы дрожжей на 1 л культуральной жидкости.
Модифицированный штамм-продуцент рекомбинантного спидроина при культивировании по усовершенствованной технологии должен давать не менее 490 мг рекомбинантного спидроина/л культуральной жидкости.
Рекомбинантный спидроин должен иметь следующие характеристики: не должен быть токсичным; относительная молекулярная масса – 94,0 Кда; должен быть способен образовывать гидрогель и нити при экструзии раствора в спирт.
Гидрогель на основе рекомбинантного спидроина должен иметь следующие характеристики: быть нерастворимым в воде; обладать устойчивостью к гидролитической деструкции – не менее 20 суток; обладать химической стабильностью в растворах слабых кислот и щелочей; обеспечивать адгезию и пролиферацию эукариотических клеток; отсутствие токсичности продуктов распада; обеспечивать васкуляризацию и иннервацию in vivo.
Микрогель, представляющий собой суспензию микрочастиц гидрогеля на основе рекомбинантного спидроина, должен иметь следующие характеристики: прозрачная суспензия, состоящая из гелеобразных частиц и водной или спиртовой фазы; быть нерастворимым в воде; не должен быть токсичным; диаметр частиц в диапазоне 50 – 300 мкм; устойчивость к гидролитической деструкции – не менее 20 суток; обладать химической стабильностью в растворах слабых кислот и щелочей; обеспечивать адгезию и пролиферацию эукариотических клеток; отсутствие токсичности продуктов распада; обеспечивать васкуляризацию и иннервацию in vivo. Масштабирование технологических процессов не должно приводить к уменьшению выхода искомого белка с единицы объема ферментационной среды.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
Конечным продуктом являются препараты гидрогеля и микрогеля на основе рекомбинантного спидроина и проект ОПР этих изделий.
Для решения описанных выше проблем будут использованы разработанные в проекте медицинские изделия в виде биорезорбирумых гидрогеля и микрогеля, производимые на основе рекомбинантных аналогов белков паутины. Эти белки определяют ряд уникальных свойств изделий in vivo: нетоксичность, высокую биосовместимость, способность к поддержанию роста клеток, к обеспечению неоваскуляризации и иннервации, способность к медленной биорезорбции, очень высокую степень пористости (в том числе естественную нано- и микропористость) по сравнению с другими материалами, положительный заряд во всем физиологическом диапазоне рН, отсутствие аллергенности и др.
Гидрогели медленно разлагаются и соединяются с тканями раны и внеклеточным матриксом, окружающим клетки, что ускоряет процессы заживления. Для успешной репарации необходимо, чтобы клетки могли свободно передвигаться, чему способствуют влажная среда и наличие в ране опорного матрикса, состоящего из адгезивных молекул. В этом контексте гидрогели на основе рекомбинантного спидроина имеют преимущество перед гидрогелями на основе синтетических материалов: кроме того, что они обладают всеми полезными свойствами гидрогелей, они также характеризуются очень высокой способностью к адгезии и пролиферации клеток и обладают природным антибактериальным эффектом. Так, нами было показано, что материалы на основе рекомбинантного спидроина (в том числе гидрогели и микрогели) прекрасно адгезировали и поддерживали пролиферацию гепатоцитов, кардиомиоцитов, клеток кости, фибробластов, эпителиальных и мезенхимальных клеток, вызывали васкуляризацию и иннервацию в зоне дефекта при подкожном введении животным. Скорость их биодеградации соизмерима со скоростью регенерации новой ткани, а продуктами распада являются аминокислоты. Такая высокая биосовместимость способствует «правильной» регенерации поврежденной ткани и предотвращению образования шрамов и килоидных рубцов, что является одной из крупных и труднорешаемых проблем при лечении ран. Кроме того, микрогели на основе рекомбинантного спидроина с размерами частиц в 200-300 мкм обеспечивают лучшую газо- и влагопроницаемость, могут быть нагружены любыми биологически активными соединениями и лекарствами и, при необходимости, могут легче вымываться из раны.
Уникальные свойства спидроина и изделий из него обясняются также тем, чтоспидроин содержит аминокислотные последовательности, обладающие регуляторными свойствами, как, например, последовательность GRGGL, которая является сигнальной для развития нейрональных клеток. Кроме того, установлено, что у 1F9 есть сродство (35-42%) с белками внеклеточного матрикса (ВКМ), такими как коллагены различных типов и эластин и гомология с hornerin – регуляторным белком, экспрессия которого повышается в регенерирующей кожной ткани при различных поражениях и патологиях.
Эти свойства изделий явлются основой того, что раневые гидрогелевые покрытия на основе рекомбинантных спидроинов удовлетворяют большинству требований к раневым покрытиям: создавать оптимальную микросреду для заживления ран; иметь достаточную проницаемость для газов и для паров воды; иметь эластичность; не обладать пирогенным, антигенным, токсическим и аллергическим действием. Кроме этого такие покрытия могут быть носителями лекарственных веществ и других биологически активных веществ (гормоны роста и т.п.), не требовать их удаления, полностью замещаться клетками кожи.
Учитывая свойства этих изделий, и в том числе способность к индукции регенерационных процессов в ране, ожидается, что они будут наиболее эффективны после очищения раны (и трофических язв) от некротизированных тканей при начинающемся росте здоровых грануляций, т.е. при переходе 1 фазы заживления во 2 фазу и в период эпителизации раны.
Разрабатываемые в проекте медицинские изделия в виде гидрогеля и микрогеля на основе рекомбинантного белка паутины являются материалами, соответствующими трендам научно-технического развития в области лечения ожогов и регенерации тканей. По уровню проработанности эти изделия находятся в числе мировых лидеров среди медизделий на основе рекомбинантных белков паутины.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Разработанные медицинские изделия в виде гидрогеля и микрогеля на основе рекомбинантного аналога белка паутины займут два сегмента рынка медицинских изделий для заместительной и восстановительной (регенерационной) медицины: лечение ожогов и ран, трофических язв («синдром диабетической стопы»), замещение дефектов мягких и хрящевых тканей, а также рынок имплантируемых носителей для трансплантации клеток и тканевой инженерии, включая создание гибридных органов, таких как печень, селезенка, поджелудочная железа.
Также разработанные изделия на основе рекомбинантных аналогов белков паутины найдут применение в косметологии в виде кремов для устранения возрастных изменений кожи и в качестве филеров.
Результаты могут быть востребованы специализированными ЛПУ (ожоговые, онкологические, дерматовенерологические - при осложненных вторично инфицированных дерматитах, отделения гериатрии и педиатрии, родильные и гинекологические отделения, отделения ухода за лежачими больными, отделения пластической и реконструктивной хирургии, отделения травматологии и т.д.), медицинскими центрами и клиниками, научно-исследовательскими и медицинскими учебными институтами, работающими в области восстановительной и заместительной хирургии, включая тканевую инженерию, такими как: НИИ скорой помощи им. Склифосовского, НИИ хирургии им. Вишневского, ФМБЦ им. А.И.Бурназяна ФМБА России, ФНЦ трансплантологии и искусственных органов им. В.И.Шумакова, «Федеральный научно-клинический центр специализированных видов медицинской помощи и медицинских технологий Федерального медико-биологического агентства», частными компаниями, занимающимися производством медицинских изделий «Трикардикс» и «МедИнж».
Выполнение предлагаемого проекта позволит создать первое в России производство принципиально новой продукции: микро- и наноструктурированных биополимерных имплантатов для оказания высокотехнологичной медицинской помощи в области восстановительной хирургии (регенеративной медицины), а также косметологии.

Текущие результаты проекта:
Проведенная генетическая модификация штамма–продуцента рекомбинантного спидроина, упрощенная схема ферментации и усовершенствование стадии экстракции и очистки рекомбинатного спидроина привели к увеличению на 40% выхода биомассы и на 60% - искомого белка, что позволило упростить процесс хроматографической очистки. Разработан ЛР получения рекомбинатного спидроина с использованием 30-л ферментера для выращивания биомассы штамма-продуцента. Усовершенствованы стадии приготовления гидрогеля и микрогеля, разработана усовершенствованная методика процесса гелеобразования, позволяющая ускорить процесс. Наработаны экспериментальные образцы биомассы штамма-продуцента и рекомбинантного спидроина по ЛР. Проведенные исследовательские испытания продемонстрировали, что ЛР с использованием 30-л ферментера позволяет получать воспроизводимые выходы высокоочищенного рекомбинантного спидроина, а полученные значения характеристик всех образцов полностью укладываются в диапазоны значений, заданных ТЗ. Исследовательские испытания экспериментальных образцов гидрогеля и микрогеля показали наличие макро- и микропористости образцов (размер пор, соответственно, 500 мкм, и 2-20 мкм), а также микро- и нанорельефа поверхности (структуры размером 0,5-15 мкм и 100-500 нм, соответственно), что привлекательно для адгезионных клеточных культур. Разработаны ЛР получения гидрогеля и микрогеля на основе рекомбинантного спидроина. Разработаны ПМ исследовательских испытаний экспериментальных образцов гидрогеля и микрогеля, предназначенных для технических, санитарно-химических и токсикологических испытаний. Наработаны экспериментальные образцы рекомбинатного спидроина, на их основе приготовлены экспериментальные образцы гидрогеля и микрогеля для проведения технических, санитарно-химических и токсикологических испытаний и проведены исследования их технических, физико-химических и медико-биологических свойств свойств. Экспериментальные образцы обеспечивали эффективную адгезию, пролиферацию и жизнеспособность эукариотических клеток при культивировании, а в экспериментах на лабораторных животных иннервацию и васкуляризацию в зоне регенерации. Разработаны проекты ТУ на рекомбинантный спидроин, гидрогель и микрогель. Проведено исследование экспериментальных образцов гидрогеля и микрогеля на цитотоксичность. Осуществлено масштабирование процессов подготовки посевного материала, процесса культивирования штамма-продуцента в 100-л ферментере и процесса экстракции рекомбинатного спидроина из водонерастворимой фракции клеток дрожжей.
Проведены эксперименты in vitro и in vivo по определению возможных методов применения гидрогеля и микрогеля при лечении ран. В экспериментах на лабораторных животных с моделированием термического ожога и полнослойной раны установлено, что нанесение гидрогеля и микрогеля на поверхность ожоговой раны и подкалывание образцов под поверхность раны ускоряет заживление ран и уменьшают вероятность образования рубца по сравнению с традиционными методами лечения. Результаты проведенных исследований позволяют предположить, что перспективными областями применения стимулирующих свойств спидроина могут быть также терапия мышечных патологий (дистрофий) и эстетическая медицина.
Все поставленные в ТЗ задачи выполнены полностью, а все полученные результаты по физико-химическим и биологическим свойствам рекомбинантного спидроина, гидрогеля и микрогеля, получаемых по ЛР, находятся в пределах интервалов, заданных в ТЗ для этих показателей. Это свидетельствуют о том, что разработанные в процессе выполнения 2-го и 3-го этапов лабораторные регламенты получения рекомбинатного спидроина, гидрогеля и микрогеля из него не приводят к ухудшению их технических, физико-химических и биологических свойств. Результаты выполняемой ПНИ находится на мировом уровне, не уступают лучшим достижениям в данной области и обеспечивают создание новой высококонкурентной продукции медицинского назначения.