Регистрация / Вход
Прислать материал

Лазерная масс-спектрометрия биологических объектов при атмосферном давлении для выявления патологических изменений и лекарственного мониторинга биологических тканей.

Номер контракта: 14.579.21.0020

Руководитель: Алимпиев Сергей Сергеевич

Должность: Заведующий лабораторией лазерной масс-спектрометрии ООО "НЭТ"

Аннотация скачать
Презентация скачать
Ключевые слова:
лазерная хирургия, масс-спектрометрические изображения, обнаружение лекарств, диагностика онкологии, атмосферная ионизация, математическое моделирование, ионная оптика.

Цель проекта:
Разработка физико-технических основ нового метода масс-спектрометрического анализа биологических тканей, обладающего высоким пространственным разрешением и возможностью послойного анализа для обнаружения патологических участков ткани, включая диагностику онкологических поражений, определения пространственного распределения лекарственных и маркерных препаратов в тканях. Создание макета лазерного масс-спектрометра для анализа образцов биологических тканей при атмосферном давлении с ионизацией излучением лазерной плазмы и разработка методики его применения.

Основные планируемые результаты проекта:
В результате выполнения проекта будут разработаны физико-технические основы нового метода масс-спектрометрического анализа биологических тканей и создан макетный образец прибора для анализа биологических тканей в состоянии «как они есть» при атмосферном давлении, получения масс-спектрометрических изображений, как плоских, так и объемных, для обнаружения патологических
участков ткани, включая диагностику онкологических поражений, определения пространственного распределения лекарственных и маркерных препаратов в тканях.
В ходе выполнения проекта будут разработаны:
- Технология лазерного испарения анализируемых образцов тканей и транспортировки нейтральных
продуктов испарения в зону ионизации.
- Методика моделирования и математическая модель процессов транспортировки ионов из области
ионизации при атмосферном давлении в масс-анализатор.
- Эскизная конструкторская документация на ионный источник, разработанный по результатам
математического моделирования процессов транспортировки ионов и экспериментального исследования
процессов ионизации.
- Макет лазерного масс-спектрометра с разработанным ионным источником для анализа образцов
биологических тканей при атмосферном давлении.
- Методика применения созданного макета лазерного масс-спектрометра для анализа образцов
биологических тканей.
- Рекомендации по использованию результатов проведенных ПНИ в реальном секторе экономики.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
Разработка инструментальных методов анализа биологических тканей, обеспечивающих наиболее полный анализ как молекулярного состава собственно ткани, так и внесенных в нее соединений (лекарств, маркерных соединений) является основным направлением совершенствования современной медицинской диагностики. Такие методы должны обеспечивать анализ реальных тканей без длительной процедуры подготовки пробы в реальном времени, так как любая процедура подготовки пробы не только увеличивает
время анализа, но и вносит неустранимые искажения в результаты анализа.
В настоящее время в этом направлении развивается несколько подходов, основанных, в частности, на
регистрации люминесценции специально введенных красителей накапливающихся в патологических
участках ткани [1] или анализе собственной люминесценции патологических участков. Развивается также
подход, основанный на регистрации рассеяния света специально введенными маркерными соединениями и
целый ряд других подходов, включая и традиционные методы. Однако по объему получаемой информации
и чувствительности масс-спектрометрия находится вне конкуренции с другими методами анализа. В масс-
спектре органических образцов могут регистрироваться одновременно сотни соединений, что позволяет
провести анализ ткани с целью выявления патологии, в том числе онкологической, или обнаружения
лекарственных и маркерных препаратов. Поэтому разработка масс-спектрометрических методик анализа
образцов тканей в реальном масштабе времени является исключительно актуальной задачей.
Существует пример решения этой задачи, известный как «умный скальпель» [2]. При использовании в
операции хирургического лазера продукты испарения, полученные при рассечении ткани в реальном
времени анализируются масс-спектрометром, предоставляя информацию хирургу о типе разрезаемой ткани
(мышцы, кожа, внутренние органы и т.п.) и о наличии в ней лекарств или признаков онкологических
поражений. Однако практическое применение такого инструмента ограничено несколькими факторами.
Два разных процесса, т.е. процесс испарения ткани и процесс ионизации продуктов испарения объединены
и происходят непосредственно в зоне действия хирургического лазера. Эти процессы по-разному зависят
от режимов воздействия, что практически исключает какое-либо количественное определение состава
удаляемой ткани. Пространственное разрешение метода соответствует размеру лазерного реза и составляет
единицы миллиметров. Такой инструмент может различить тип ткани, но бесполезен в определении
незначительных, невидимых глазом, изменений ткани, вызванных онкологическим процессом.
Вторым примером реализации масс-спектрометрического анализа биотканей является использование
технологии матрично активированной лазерной десорбции-ионизации (МАЛДИ) [3]. В этом случае перед
испарением на анализируемую поверхность ткани наносится специальное протонодонорное соединение
(матрица), которая также исполняет две функции. С одной стороны матрица, обладая высоким
коэффициентом поглощения лазерного излучения, обеспечивает эффективное удаление поверхностного
слоя ткани, а с другой стороны приводит к достаточно эффективной ионизации продуктов испарения ткани
путем передачи протона от молекулы матрицы молекулам испаренного вещества. Очевидно, что в этом
случае в ход аналитического процесса включается достаточно сложная процедура подготовки образца. Это
не является помехой при получении масс-спектрометрических изображений отдельно взятых проб тканей
“in vitro”, но является непреодолимым препятствием для проведения диагностики в режиме реального
времени, как например, во время хирургического вмешательства в организм. Эта техника позволяет
уверенно регистрировать онкологические поражения ткани с высоким, на уровне десятков микрон,
пространственным разрешением, однако требует длительной процедуры подготовки пробы.
Из приведенных примеров видно, что технологии масс-спектрометрического анализа биологических
тканей востребованы, но требуют существенного совершенствования и развития. При этом важно
реализовать возможность масс-спектрометрического анализа состава ткани в состоянии как она есть, при
атмосферном давлении, в реальном масштабе времени и с максимально высоким пространственным
разрешением. Высокое пространственное разрешение неизбежно требует увеличения чувствительности
метода из-за малости объема забираемого вещества. Увеличение чувствительности масс-
спектрометрического анализа при ограниченности анализируемого вещества возможно за счет увеличения
эффективности ионизации и оптимизации транспортировки полученных ионов входным трактом масс-
спектрометра.
Исследования по совершенствованию методов масс-спектрометрического анализа биологических объектов
ведутся многими ведущими лабораториями мира, основные предлагаемые подходы рассмотрены в
обзорной статье [4]. Авторами проекта предложен свой подход, основанный на разделении процессов
испарения пробы и ионизации продуктов испарения. При этом в качестве ионизатора предложено
использовать излучение лазерной плазмы, формирующейся на специальной мишени вне зоны испарения
образца. На предложенный способ анализа получен патента РФ на изобретение № 2012139218 «Способ анализа химического состава материалов» от 13.09.2012. Предложенный способ анализа получил название APLPI (Atmospheric Pressure Laser Plasma Ionization), а первые проведенные эксперименты, выполненные на модельных образцах, показали исключительно высокую эффективность
ионизации предлагаемого метода и, кроме того, возможность анализа образцов в состоянии как они есть
при атмосферном давлении с пространственным разрешением на уровне 30 мкм [5].
В основе предлагаемого метода лежит разделение процессов испарения ткани и ионизации полученных
газообразных продуктов. Масс-спектрометрический анализ продуктов испарения в реальном времени с
использованием ионизации, осуществляемой независимым источником вне устройства забора пробы,
позволит идентифицировать свойства ткани в труднодоступных участках для задач ранней диагностики
онкологии. Примером области, где технология представляется востребованной - это эндоскопия и
лапароскопия с использованием зондов и манипуляторов, снабженных волоконной системой доставки
испаряющего лазерного излучения. Технология мгновенной идентификации “in vivo” позволит избежать
неопределенности при взятии биопсии из визуально не контрастных участков. Второй особенностью
предлагаемого подхода является возможность обнаружения и определение пространственного
распределения не только веществ, генерируемых в тканях, но и лекарственных и маркерных препаратов.
Это может использоваться для обнаружения патологических участков ткани, не идентифицируемых
визуально по изменению (контрасту) содержащихся в ткани маркерных соединений.
Еще одной задачей, требующей решения при разработке масс-спектрометрического метода анализа
биологических тканей, является минимизация потерь при транспортировке ионов из области ионизации,
находящейся при атмосферном давлении в вакуумную камеру масс-спектрометра. Среди систем ввода
ионов из атмосферы в вакуум в настоящее время преобладают устройства, использующие только
газодинамические принципы транспортировки. Такой ввод, «всасывающий» ионы в камеру прибора, даже
при мощной системе откачки не обеспечивает эффективной передачи ионов в масс-спектрометр. Потери,
как правило, превышают 90%. Известно, что для увеличения эффективности системы ввода необходимо
использовать электрические поля для фокусировки ионного пакета. Эта идея реализована в системах типа
«ионная воронка» (ion funnel) путем запирании потока ионов в канале высокочастотными полями. Метод
обладает высокой эффективностью транспортировки (десятки процентов), но его существенным
недостатком является невозможность работы при атмосферном давлении.
В условиях клинической диагностики количество испаряемого материала или концентрации искомых
веществ могут быть сильно ограничены, что требует разработки эффективной системы ввода ионов из
атмосферы в вакуумную часть масс-спектрометра. Явных физических предпосылок, препятствующих
созданию такого устройства, не существует. Однако разработка технологии, объединяющей преимущества
ионной оптики и газодинамики, требует не только качественного понимания основных эффектов,
оказывающих значительное влияние на транспортировку ионов (турбулентности, граничные особенности
поля, групповое взаимодействие ионов, ионный ветер), но и их точного количественного анализа.
Наиболее эффективным методом получения информации об особенностях этих физических процессов
является математическое моделирование. Необходимо разработать принцип работы эффективной и
универсальной методики, совмещающей достижения в областях газодинамики и ионной оптики и
лишенной недостатков, присущих узкоспециализированным подходам.
Таким образом, применение масс-спектрометрических методов для анализа биологических тканей при
атмосферном давлении в реальном масштабе времени и без предварительной подготовки пробы требует
решения комплекса научных проблем. Прежде всего, это проблема связанная с процессом лазерного
испарения ткани с максимально высоким пространственным разрешением и возможностью послойного
анализа, проблема транспортировки пробы испаренного вещества в зону ионизации, разработка
эффективного метода ионизации сложных органических соединений в газовой фазе с минимальными
ограничениями по классам химических соединений, а также проблема эффективной транспортировки
полученных ионов в масс-спектрометр. На решение этих научно технических проблем и направлен
предлагаемый проект.
3. Публикации по теме ПНИ, в том числе зарубежные
1. Primeau, 2005, “The Distribution of the Anticancer Drug Doxorubicin in Relation to Blood Vessels in Solid
Tumors”. Clinical Cancer Research. 7.837
http://clincancerres.aacrjournals.org/content/11/24/8782
doi: 10.1158/1078-0432.CCR-05-1664
2. Schafer, 2011, “In Situ, Real-Time Identification of Biological Tissues by Ultraviolet and Infrared Laser
Desorption Ionization Mass Spectrometry”. Analytical Chemistry. 5.695
http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac102613m
DOI: 10.1021/ac102613m
3. Schwamborn, 2010, “Molecular imaging by mass spectrometry — looking beyond classical histology”. Nature
Reviews Cancer. 35.000
http://www.nature.com/nrc/journal/v10/n9/full/nrc2917.html
DOI:10.1038/nrc2917
4. Monge, 2013, “Mass Spectrometry: Recent Advances in Direct Open Air Surface Sampling/
Ionization” .Chemical Reviews. 41.298
http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/cr300309q
DOI: 10.1021/cr300309q
5. Pento, 2013, "Laser ablation and ionisation by laser plasma radiation in the atmospheric-pressure mass
spectrometry of organic compounds". Quantum Electronics. 0.823
http://www.turpion.org/php/paper.phtml?journal_id=qe&paper_id=15065
DOI: 10.1070/QE2013v043n01ABEH015065

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Разрабатываемые научно-технологические подходы могут быть применены для решения задач
фармакинетики, таких как идентификация малых количеств лекарственных препаратов в биологических
тканях, для изучения концентрирования фармацевтических препаратов в тканях и органах.
Применение разрабатываемых подходов в решении гистологических задач позволит проводить
идентификацию типа ткани, изучение пространственного распределения веществ в тканях для выявления
признаков различных патологий, в том числе, онкологических поражений.
Возможность анализа исследуемого объекта без его предварительной подготовки при атмосферном
давлении даст возможность проводить экспресс-анализ тканей непосредственно в области оперативного
вмешательства. Это даст хирургу возможность получить дополнительную информацию о состоянии ткани,
провести локализацию патологии даже в случае, если этого не удаётся сделать визуально. Более того,
разрабатываемые технологии позволят проводить анализ тканей при помощи малоинвазивной хирургии и
эндоскопии в тех случаях, где не требуется прямое хирургическое вмешательство или для задач
диагностики внутренних органов.
Приборы на основе разрабатываемых научно-технических принципов могут быть установлены в
клинических, клинико-диагностических медицинских учреждениях, научно-исследовательских
учреждениях, ориентированных на биологические и биомедицинские исследования, экспресс-
лабораториях для проведения анализов.
Кроме того, технология может быть применена для экспресс-анализа пищевых продуктов, определения
фальсификатов или присутствия вредных веществ, для решения задач микробиологии, идентификации и
изучения бактериологических штаммов. Возможны применения в допинг-контроле, токсикологии,
экологии и криминалистике.
Так, в экологии появляется возможность определения загрязнений непосредственно на природных
объектах без стадии выделения и концентрирования целевых соединений перед масс-спектрометрическим
анализом. Эта задача близка к более узкой задаче определения следов взрывчатых и наркотических
веществ на реальных поверхностях в задачах служб безопасности. В проблемах безопасности продуктов
питания появляется возможность прямого анализа продуктов для определения химических соединений,
опасных для человека, решения проблем фальсификации продуктов питания, выявления случаев
применения запрещенных или не объявленных в описании продукта добавок и пр.

Текущие результаты проекта:
Проведены патентные исследования в соответствии с ГОСТ 15.011-96.
Выполнен аналитический обзор научных и информационных источников, затрагивающих проблему масс-спектрометрического анализа биологических тканей при атмосферном давлении, в т.ч. с использованием лазерной ионизации и проблемы расчета движения ионов при атмосферном давлении с учетом электрических полей и газодинамических явлений.
Осуществлен выбор и обоснование направлений исследований, в том числе разработаны возможные решения исследовательских задач.
Разработана математическая модель и исследованы процессы транспортировки ионов из области ионизации при атмосферном давлении в масс-анализатор с учетом электрических полей и газодинамических явлений.
Определена оптимальная конфигурация электродов ионно-оптического газодинамического тракта макета ионного источника.
Произведен расчет параметров макета ионного источника на основе лазерной плазмы.
Проведено обоснование выбора режимов лазерного испарения биологических тканей для масс-спектрометрического анализа и определены параметры лазерных источников.
Проведено экспериментальное исследование режимов лазерного испарения/абляции образцов тканей под действием трех типов лазеров Nd-YLF, Er-YAG и CO2 с длинами волн 263 нм, 2.97 мкм и 10.6 мкм соответственно и в диапазоне длительностей импульсов от 3 нс до 100 мкс.
Исследованы механизмы ионизации продуктов испарения в диапазоне давлений 0.1 – 1 атм. в присутствии лазерной плазмы.
Определены оптимальные параметры нагреваемого канала транспортировки продуктов испарения образцов, т.е. его температура и сечение в диапазоне давлений 0.1-1 атм.
Разработана эскизная конструкторская документация и изготовлен макет ионного источника. Проведены его исследовательские испытания.
Разработана эскизная конструкторская документация на макет лазерного масс-спектрометрадля анализа образцов биологических тканей при атмосферном давлении с ионизацией излучением лазерной плазмы.