Регистрация / Вход
Прислать материал

Создание полифункционального биологического препарата для обеспечения сельскохозяйственных моногастричных животных и птицы L-лизином in situ и технологии его производства

Номер контракта: 14.579.21.0021

Руководитель: Фисинин Владимир Иванович

Должность: Первый вице-президент Россельхозакадемии

Аннотация скачать
Постер скачать
Презентация скачать
Ключевые слова:
l-лизин, биопрепарат, молочнокислый микроорганизм, пробиотик, t-rflp анализ, моногастричные животные, сельскохозяйственная птица, промышленное свиноводство и птицеводство

Цель проекта:
Целью настоящей работы является разработка биопрепарата на основе пробиотического штамма молочнокислого микроорганизма, синтезирующего L-лизин в организме сельскохозяйственных моногастричных животных и птицы, и создать технологию его производства. Основные источники белка для сельскохозяйственных животных – корма растительного происхождения. Но кормовые белки, как таковые, перестают существовать уже на стадии пищеварения. Во всех дальнейших биохимических процессах участвуют продукты их ферментативного расщепления, в основном аминокислоты. Неудовлетворительные условия хранения, заготовки, переработки, тепловой обработки кормов, наличие в них плотных полисахаридных оболочек, низкая растворимость в желудочно-кишечном тракте и недостаточная доступность для пищеварительных ферментов, различная скорость всасывания и транспорта в ткани, а также антагонизм между аминокислотами, существенно снижают их эффективность. Полностью реализовать генотип моногастричных животных и птицы можно только при кормлении их кормами, сбалансированными по всем питательным и биологически активным веществам и, в частности, по лизину. Для стимулирования роста животных и птицы в птицеводстве и свиноводстве используются добавки на основе синтетического L-лизина. Большинство производств находятся в Китае, Корее, США. В настоящее время синтетическая аминокислота L-лизин, применяемая в сельском хозяйстве в Российской Федерации, производится всего лишь на одном предприятии в Белгородской области. Одна из острейших проблем российского животноводства – высокие расходы на корма, которые составляют на сегодняшний день 70-75% в структуре издержек животноводческих хозяйств. По данным ФГУП «Госниигенетика» в стране происходит рост потребления незаменимой аминокислоты лизина на 15% ежегодно. По состоянию за 2012 год, в Россию было импортировано не менее 50 000 т лизина стоимостью порядка 3-х долларов за кг. Лизин является обязательным компонентом рационов свиней и птицы, дефицит лизина приводит к падению продуктивности животных. Рост курса доллара приводит к повышению стоимости лизина, и, соответственно, снижает рентабельность отечественных сельхозпредприятий. Также в промышленном производстве свиного и куриного мяса также остро стоит проблема сохранности животных по причине легочных и кишечных заболеваний. Возможное решение проблемы –применение кормовой добавки на основе штамма молочнокислой бактерии Lactobacillus plantarum - продуцента лизина и биологически активных веществ, подавляющих условно-патогенную и патогенную микрофлору, и позволяющих проводить эффективную профилактику заболеваний за счет повышения резистентности организма. Необходимо отметить, что реализация проекта будет способствовать решению ряда отраслевых проблем: - увеличение издержек животноводческих хозяйств на корма и ветеринарные препараты при выращивании высокопродуктивных сельскохозяйственных животных; - рост потребления лизина и пробиотиков в связи с ростом отраслей птицеводства и свиноводства; - повышение требований к качеству продукции птицеводства и свиноводства в связи с вступлением России в ВТО, в том числе требований по замене кормовых антибиотиков в рационах питания животных на пробиотики и фитобиотики и др. антимикробные кормовые добавки. Реализация проекта связана с выполнением разделов 5.6 «Биопрепараты для животноводства», 5.9 «Биологические компоненты кормов и премиксов» Комплексной программы развития биотехнологий в Российской Федерации на период до 2020 года». В рамках контракта планируется создание экономически эффективного и экологически безопасного биопрепарата нового поколения для птицеводства и свиноводства на основе пробиотического микроорганизма Lactobacillus plantarum , который способен продуцировать в полуанаэробной среде желудочно-кишечного тракта сельскохозяйственной птицы и свиней незаменимые аминокислоты, в том числе L-лизин. Штамм получен селекционным путем и использует желудочно-кишечный тракт как естественный биологический реактор. Разрабатываемый биопрепарат будет обладать высокой пробиотической активностью, повышать неспецифический иммунитет за счет влияния на микрофлору желудочно-кишечного тракта, способствовать увеличению продуктивности сельскохозяйственных животных и птицы, повышению качества продукции свиноводства и птицеводства. По совокупности характеристик и эффективности разрабатываемый продукт не имеет аналогов в мире. Предлагаемый к реализации проект может способствовать решению следующих проблем: • обеспечить продовольственную безопасность страны в сфере обеспечения населения птицеводческой продукцией; • создать экономическую основу для ускоренного устойчивого развития отечественного птицеводства и свиноводства, не зависящего от мировой конъюнктуры. По механизму действия аналогов данного биопрепарата в настоящее время нет. Для достижения цели проекта поставлены следующие задачи. Провести сравнительную оценку вариантов возможных решений исследуемой проблемы с учетом результатов прогнозных исследований, проводившихся по аналогичной тематике. Для этого будет использован Интернет-ресурс, в т.ч. научные базы данных ISI Web of Knowledge, http://apps.isiknowledge.com/, а также научные публикации, предоставляемые РФФИ, www.elibrary.ru, Национальной Медицинской Библиотекой США Национального института здоровья США, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/. Предложить штамм, продуцирующий лизин непосредственно в организме животного, и провести его комплексное исследование в соответствии с рекомендациями ФАО/ВОЗ, а именно: - изучить физиолого-биохимические, молекулярно-генетические и технологические свойства нового штамма Lactobacillus plantarum; - определить пробиотические свойства штамма, в том числе адгезию на линии эпителиальных клеток человека, и иммуномодулирующую активность; - изучить отношение штамма к антибиотикам различных групп с оценкой потенциальной опасности распространения трансмиссивных генов антибиотикоустойчивости; - определить механизм синтеза L-лизина новым штаммом Lactobacillus plantarum, установить необходимый уровень синтеза лизина, соответствующий суточной норме для сельскохозяйственной птицы и свиней, и предложить пути повышения синтеза L-лизина; - установить стабильность синтеза лизина штаммом Lactobacillus plantarum во время пересевов и хранения; - предложить методы контроля и идентификации штамма Lactobacillus plantarum во время промышленного производства и оборота. Разработать биопрепарат для обеспечения сельскохозяйственной птицы и свиней лизином in situ и техническую документацию на него: - создать модели для in vitro и in vivo тестирования функциональных свойств биопрепарата, в том числе бифидогенной активности, количества вводимого синтетического лизина в рационы птицы и свиней наряду с приемом разработанного биопрепарата; конверсии кормов в организме птицы и свиней; сохранности сельскохозяйственной птицы и свиней; - определить влияние штамма бактерии-продуцента лизина на микрофлору кишечника птицы с помощью молекулярно-генетического метода на основе T-RFLP-анализа. Исследовать эффективность штамма бактерии-продуцента лизина в птицеводстве путем определения следующих показателей в ходе исследований кормленческих и балансовых опытов на сельскохозяйственной птице: - сохранности поголовья путем учета отхода и установления его причин; - живого веса в динамике роста путем индивидуального взвешивания всего поголовья по группам; - потребления кормов группового, за весь период выращивания, кг на голову; - затрат корма на 1 кг прироста живой массы в конце опыта; - переваримости и использования питательных веществ корма по результатам физиологического опыта; - химического состава тканей и органов животного.

Основные планируемые результаты проекта:
В ходе выполнения НИР были получены следующие результаты:

Проведено генотипирование штамма Lactobacillus plantarum L-211. Для идентификации микроорганизмов до вида был применен метод ПЦР с использованием видоспецифических праймеров рибосомальных последовательностей. По результатам ПЦР-анализа с использованием видоспецифических праймеров исследуемый штамм можно отнести к виду Lactobacillus plantarum.
Проведена паспортизация штамма с помощью ДНК-фингерпринта методом ПЦР с использованием штаммоспецифических праймеров. Для ДНК-фингерпринта был использовано несколько молекулярно-биологических методов анализа ДНК, в том числе анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов, пульс-электрофорез, риботипирование, а также несколько вариантов полимеразной цепной реакции (ПЦР). После электрофоретического разделения продуктов этих реакций получается набор фрагментов, так называемый ДНК-фингерпринт.
Разработаны методы контроля и идентификации штамма Lactobacillus plantarum. Для контроля качества бактериального препарата на основе молочнокислого микроорганизма, синтезирующего лизин, была разработана методика, позволяющая гарантировать безопасность бакпрепарата и контролировать соответствие микроорганизма, находящегося в технологическом цикле, культуре Lactobacillus plantarum L-211.
Определены основные требования к инновационному биопрепарату и проведена его разработка. Была проведена оптимизация процесса
культивирования производственного штамма Lactobacillus plantarum L-211. Было проведено сравнительное исследование кинетики роста и выхода биомассы лактобактерий на питательных средах различного состава. При этом особое снимание уделялось на промышленную доступность компонентов питательных сред и стабильность их качества.
Разработаны лабораторные методики тестирования функциональных свойств биопрепарата. Была проведена разработка методики на основе T-RFLP-анализа микрофлоры слепых отростков бройлеров и исследований по устранению дефицита лизина в комбикормах мясной птицы.
Разработан лабораторный регламент получения биопрепарата с заданными составом и функциональными свойствами, включая методы контроля его функциональных свойств и качества.
Проведена наработка экспериментальных образцов биопрепарата.
Проведены исследовательские испытания экспериментальных образцов биопрепарата. Для реализации поставленной задачи был проведен опыт на цыплятах-бройлерах кросса «Кобб-500» в условиях вивария ОНО «Загорское ЭПХ ВНИТИП». Результаты наших исследований подтвердили возможность применения прерывистых режимов выпойки продуцента лизина на основе Lactobacillus plantarum L-211 для устранения дефицита лизина в комбикормах мясной птицы.
Изучены безвредность, «острая» и хроническая токсичность, токсигенность, вирулентность штамма Lactobacillus plantarum L-211 на лабораторных животных, в соответствии с методическими указаниями МУК 4.2.2602-10 «Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Система предрегистрационного доклинического изучения безопасности препаратов. Отбор, проверка и хранение производственных штаммов, используемых при производстве пробиотиков», разработанными ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича Роспотребнадзора и утвержденными Роспотребнадзором 21.04.2010.
Созданы экспериментальные рецептуры комбикорма для кур и свиней.
Разработаны Планы исследований для оценки функциональных свойств кормов и биопрепарата на курах и свиньях.
Разработан проект инструкции по применению биопрепарата.

Основные характеристики планируемых результатов (в целом и/или отдельных элементов), научной (научно-технической, инновационной) продукции:

Экспериментальный биопрепарат на основе штамма молочнокислой бактерии Lactobacillus plantarum – продуцента лизина.
Титр бактерий – не менее 10 в 6 степени КОЕ/г.
Ввод биопрепарата на основе штамма бактерии Lactobacillus plantarum – продуцента лизина бройлерам позволил поднять сохранность до 100%.
При этом доступность лизина из кормов снизилась по сравнению с контролем на 2,8%.
Показатель конверсии вырос на 0,02 единицы (существенное значение).

Основные характеристики научно-технической продукции:

- промежуточный отчет о ПНИЭР;
- заявка на получение правоохранительных документов на объекты интеллектуальной собственности;
- лабораторный регламент производства биопрепарата;
- рецептуры комбикормов для свиней и кур;
- проект инструкции по применению биопрепарата;
- отчет об испытаниях биопрепарата в промышленных условиях.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
Проведена оптимизация процесса глубинного культивирования производственного штамма Lactobacillusplantarum L-211, рег. номер в коллекции ВКПМ В-11235.

Получена биомасса L.plantarum:
С полужидкого агара с продуцентом петлей засеяно 2л питательной среды следующего состава:

компонент г/л

бактопептон 10,0
мясной экстракт – 10.0
дрож. экстракт - 5
глюкоза – 20
твин 80 – 1.0
аммоний лимоннокислый – 2.0
натрий уксуснокислый – 5.0
Na2PO4 – 2.0
MgSO4 x 7H2O – 0.1
MnSO4 x 5H2O - 0.05
Агар – 2.0
H2О до 1л
рН 6,5

Посевной материал термостатировали 16 часов при t=37град.

Культивирование производилось в ферментере Биор 0,25 с объемом питательной среды равной 100л аналогичного состава. Время культивирования 10ч. при температуре 37град. КОЕ к концу ферментации 7*109/мл

Концентрирование проводилось с использованием тангециальной фильтрации. Конечный объем концентра 6,5л КОЕ=1,5 1011/мл

Состав защитной среды:

сахароза - 350гр
желатин - 70гр
сухое молоко - 100гр
вода - 1200 мл

Лиофилизация проводилась на установке LZ-45 на поддонах в слое 1см. Начальная температура сушки -45 град, конечная температура +20град. Общая время сушки 34 часа. Масса полученного лиофилизата - 950гр, влажность 4,5%, содержание микробов пробиотиков 1*1010/гр

Испытано 3 разных режима ферментации штамма:

1)Получено в 100 литровом ферментёре = 7 х 10*9 степени КОЕ/мл через 10 часов культивирования.
После лиофильной сушки получено 950 грамм = 10 х 10*9 степени КОЕ/г.

2) Получено в 100 литровом ферментёре = 6 х 10*9 степени КОЕ/мл через 16 часов культивирования.
После лиофильной сушки получено 53 грамма = 70 х 10*9 степени КОЕ/г.

3). Получено в 100 литровом ферментёре = 86 х 10*9 степени КОЕ/мл через 16 часов культивирования.
После лиофильной сушки получено 160 грамм = 1000 х 10*9 степени КОЕ/г.

В описанной ситуации на первый план выходит приоритет той технологии производства, которая при прочих равных условиях (включая объём ферментёра) которая разрешит получать большее количество (живых) КОЕ. (№3).

Оценка элементов новизны научных (технологических) решений, применявшихся методик и решений:

В работе использованы современные микробиологические, физиолого-биохимические и молекулярно-генетические подходы. Испытания на сельскохозяйственной птице соответствуют общепринятым мировым методикам.

Сопоставление с результатами аналогичных работ, определяющими мировой уровень:

Прямых аналогов проведенной работе нет. Впервые получен штамм молочнокислой бактерии, обладающей высокой пробиотической активностью и одновременно обладающей потенциалом к синтезу лизина в организме сельскохозяйственной птицы.

Пути и способы достижения заявленных результатов, ограничения и риски:

На втором и третьем этапе выполнения НИР существенных ограничений и рисков отмечено не было.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Применение нового биопрепарата для выращивания птицы и свиней позволит значительно снизить затраты предприятий на специальные кормовые добавки и повысить конкурентоспособность продукции.
Основными потребителями ожидаемого научно-технического результата являются:
− производители кормовых добавок;
− животноводство и птицеводство;
− ветеринария.

Внедрение разработки планируется на предприятии индустриального партнера – «Новгородский Бекон» (140 000 голов свиней и 2 млн. бройлеров) с последующим тиражированием на птицефабриках и свинокомплексах Российской Федерации.

Текущие результаты проекта:
1 При проведении ПЦР-анализа штамма L-211 были получены фрагменты размером 265 п.н. при использовании видоспецифических праймеров 16 и Lpl, которые свидетельствует о том, что исследуемый штамм относятся к виду Lactobacillus plantarum.
2 2 При проведении ПЦР-фингерпринта штамма Lactobacillus plantarum L-211 с праймером М13 были получены мажорные фрагменты размером 750 п.н., фрагменты средней интенсивности размером 200 п.н. и минорные фрагменты размером 300 и 550 п.н.; с праймером 1254 – мажорные фрагменты размером 300 и 500 п.н., фрагмент средней интенсивности размером 750 п.н. и минорные фрагменты размером 200 и 250 п.н., которые могут быть использованы как молекулярно-биологическая характеристика штамма.
3 Разработана Методика контроля и идентификации штамма Lactobacillus plantarum, которая включает в себя микробиологический анализ бакпрепарат, который проводят не ранее, чем через 2 суток после его выработки; изучение культуральных, морфологических и биохимических свойств штамма; идентификацию микроорганизмов с использованием тест-систем API50CHCHL; генотипические исследования, в.т.ч. проведение анализа 16S рРНК и проведение идентификации штаммам методом ПЦР с использованием видоспецифических праймеров рибосомальных последовательностей; фингерпринт штамма.
4 Определение требований к инновационному биопрепарату: рекомендовано в качестве производственной культуры использовать культуры, полученные при культивировании на полужидкой питательной среде № 1 в течение 2 суток. Срок хранения производственной культуры при +(4–6) °С – 2 месяца. Для получения посевных культур II и III генераций использовать питательную среду № 3 с посевной дозой 10–15 %.
5 Разработана Методика проведения T-RFLP-анализа микрофлоры слепых отростков бройлеров, основанная на методе T-RFLP-анализа, который включает в себя три этапа: выделение общей (тотальной) ДНК микроорганизмов; ПЦР-амплификацию фрагментов генов бактерий (16S рДНК) с флуоресцентно-мечеными праймерами; ферментативную обработку амплификата с помощью частощепящих эндонуклеаз рестрикции. Разработана Методика исследований по устранению дефицита лизина в комбикормах мясной птицы.
6 Разработан лабораторный регламент получения биопрепарата с заданными составом и функциональными свойствами, включая методы контроля его функциональных свойств и качества. Разработана технология глубинного культивирования штамма-продуцента лактобактерий, которая позволяет масштабировать процесс в полупромышленных условиях.
7 Проведена наработка экспериментальных образцов биопрепарата при глубинном культивировании в ферментере. Наработана опытная партия биопрепарата на основе штамма Lactobacillus plantarum L-211.
8 Разработаны программы и методики исследовательских испытаний полифункционального биологического препарата для обеспечения сельскохозяйственных моногастричных животных и птицы L-лизином in situ.
9 Результаты исследований подтвердили возможность применения прерывистых режимов выпойки продуцентов лизина на основе Lactobacillus plantarum и Escherichia сoli для устранения дефицита лизина в комбикормах мясной птицы. Использование препарата Абиопептид улучшает активацию лиофильно высушенных продуцентов и способствует большей выработке ими лизина. Применение Абиопептида в дозе 3 мл/л в сочетании с продуцентом лизина на основе Escherichi aсoli в дозе 1×108 КОЕ/мл 1 раз в 7 дней позволяет обеспечить получение сравнимой с контролем продуктивности и сравнимо с действием 0,41–0,51 г монохлоргидрата лизина.
10 По показателям безвредности, токсичности, токсигенности и вирулентности штамм Lactobacillus plantarum L-211 (В-11235) может быть признан безопасным. Пероральное введение суточной живой культуры штамма Lactobacillus plantarum L-211 не приводит к развитию во внутренних органах и ЦНС мышей изменений, указывающих на наличие токсического действия.
11 Проведена работа по балансированию ингредиентов кормов для замены монохлоргидрат лизина и определена возможность применения штамма Lactobacillus plantarum для синтеза лизина в дефицитных по лизину комбикормах для цыплят-бройлеров. Создана экспериментальная рецептура корма, которую планируется применять в последующих испытаниях.
12 Создана экспериментальная рецептура корма, которую планируется применять в последующих испытаниях. Особую роль в применение данной рецептуры является применение препарата на основе штамма Lactobacillus plantarum L-211 для компенсации недостатка аминокислоты лизина и улучшения состояния желудочно-кишечного тракта.
13 В рамках работ по внебюджетных средствам, в соответствии с планом исследований на животных, составленным на 1 этапе работы, был заложен опыт на свиньях в хозяйстве ООО «Новгородский бекон». Были созданы 2 группы животных по 700 голов каждая. Первая группа – опытная, выпаивалась экспериментальным биопрепаратом на основе штамма Lactobacillus plantarum L-211, вторая группа – контрольная, стандартная вакцинация. Обе группы получали корм по специально подготовленной рецептуре. По результатам на 30.06.2015 создан промежуточный отчет об испытаниях.