Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка конъюгированных вакцин на основе синтетических углеводных лигандов против возбудителей госпитальных инфекций

Аннотация скачать
Презентация скачать
Ключевые слова:
pseudomonas aeruginosa, грибковые патогены, поверхностные антигены, альгинат, бета-(1→3)-глюкан, олигосахаридные фрагменты, синтез, белок-носитель, дифтерийный анатоксин crm197, конъюгированная вакцина

Цель проекта:
Целью прикладного научного исследования является разработка конъюгированных вакцинных препаратов на основе рекомбинантного белка-носителя CRM197 и синтетических спейсерированных углеводных лигандов, структурно родственных альгинату бактерии Pseudomonas aeruginosa и общему полисахаридному антигену клеточной стенки патогенных грибов – прототипов вакцин для лечения госпитальных бактериальных и грибковых инфекций. Результаты работы будут использованы для проведения доклинического исследования разработанных вакцинных препаратов и разработки технологии производства конъюгированных вакцин.

Основные планируемые результаты проекта:
I.
1. Промежуточные и заключительный отчеты о ПНИ.
2. Отчеты о патентных исследованиях в соответствии с ГОСТ Р15.011-96.
3. Методика синтеза бета-(1→4)-олигоманнуронозидов.
4. Методика синтеза бета-(1→3)-олигоглюкозидов, включающих 3, 5 и 7 моносахарид-ных звеньев.
5. Методика синтеза бета-(1→3)-олигоглюкозидов, включающих 9, 11 и 13 моносаха-ридных звеньев.
6. Методика очистки рекомбинантного белка CRM197.
7. Методика рефолдинга рекомбинантного белка CRM197 в процессе очистки.
8. Методика конъюгирования белка-носителя CRM197 с синтетическими олигосаха-ридными лигандами.
9. Компоненты для получения конъюгированных вакцинных препаратов:
 антигенные олигосахаридные лиганды – бета-(1→4)-олигоманнуронозиды;
 антигенные олигосахаридные лиганды – бета-(1→3)-олигоглюкозиды;
 рекомбинантный белок-носитель CRM197.
10. Лабораторный регламент получения конъюгированных вакцин на основе синтети-ческих олигосахаридных лигандов и белка-носителя CRM197.
11. Экспериментальные образцы конъюгированной вакцины против P. aeruginosa на основе белка-носителя CRM197 и синтетических олигосахаридных лигандов различной дли-ны – фрагментов бактериального альгината.
12. Экспериментальные образцы конъюгированной вакцины против грибов Candida и Aspergillus на основе белка-носителя CRM197 и синтетических олигосахаридных лигандов - фрагментов поверхностных углеводных антигенов патогенных грибов.
13. Методика синтеза покрывающих антигенов для оценки эффективности и специ-фичности иммунного ответа с использованием иммуноферментного анализа (ИФА).
14. Проект Технического задания на проведение ОТР по теме: «Доклинические ис-следования и разработка технологии получения кандидатной конъюгированной вакцины на основе синтетических углеводных лигандов против возбудителей госпитальных инфекций».
15. Рекомендации по возможности использования полученных результатов в реаль-ном секторе экономики.
16. Технико-экономическое обоснование разработки продукции с учетом технологи-ческих возможностей и особенностей индустриального партнера.
II
Разрабатываемые конъюгированные вакцинные препараты на основе рекомби-нантного белка-носителя CRM197 и синтетических спейсерированных углеводных лигандов предназначены для лечения и профилактики госпитальных бактериальных (Pseudomonas aeruginosa) и грибковых (Candida albicans, Aspergillus fumigatus и др.) инфекций.
Компоненты для получения конъюгированных вакцинных препаратов - -(14)-олигоманнуронозиды должны соответствовать следующим требованиям:
 должны строго соответствовать по своей структуре фрагментам бактериально-го альгината;
 структура должна быть подтверждена данными спектров ядерного магнитного резонанса (ЯМР) на ядрах 1Н и 13С и масс-спектрометрии высокого разреше-ния;
 чистота должна быть не менее 95% по данным спектров 1Н ЯМР.
Компоненты для получения конъюгированных вакцинных препаратов - -(13)-олигоглюкозиды должны соответствовать следующим требованиям:
 должны строго соответствовать по своей структуре фрагментам грибкового -(13)-глюкана;
 структура должна быть подтверждена данными спектров ядерного магнитного резонанса (ЯМР) на ядрах 1Н и 13С и масс-спектрометрии высокого разреше-ния;
 чистота должна быть не менее 95% по данным спектров 1Н ЯМР.
Компонент для получения конъюгированных вакцинных препаратов - рекомби-нантный белок CRM197 должен быть получен в количестве не менее 200 мг и должен соот-ветствовать следующим требованиям по чистоте:
 содержание белка штамма-продуцента, определенное методом иммунофер-ментного анализа (ИФА) - не более 0,2 нг/мкг белка;
 содержание ДНК штамма-продуцента, определенное методом молекулярной гибридизации - не более 2 пг/мкг белка;
 содержание бактериальных эндотоксинов - не более 10,0 ЕЭ на 1,0 мг белка.
Экспериментальные образцы конъюгированной вакцины против P. aeruginosa должны соответствовать следующим требованиям:
 содержать в среднем не менее 4-х углеводных лигандов
на молекулу белка по данным масс-спектрометрии MALDI-TOF;
 индуцировать образование IgG антител, специфичных фрагментам бактери-ального альгината, в экспериментах на животных;
 титр специфических IgG антител в иммунных сыворотках должен не менее чем в 2 раза превышать титр антител в сыворотках неиммунизированных живот-ных;
 опсонизирующая активность иммунных сывороток должна превышать актив-ность сывороток неиммунизированных животных не менее чем на 15%.
Экспериментальные образцы конъюгированной вакцины против грибов Candida и Aspergillus должны соответствовать следующим требованиям:
 содержать в среднем не менее 4-х углеводных лигандов
на молекулу белка по данным масс-спектрометрии MALDI-TOF;
 индуцировать образование IgG антител, специфичных фрагментам грибкового -(13)-глюкана, в экспериментах на животных;
 титр специфических IgG антител в иммунных сыворотках должен не менее чем в 2 раза превышать титр антител в сыворотках неиммунизированных живот-ных;
 опсонизирующая активность иммунных сывороток должна превышать актив-ность сывороток неиммунизированных животных не менее чем на 15/


Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
Будут созданы экспериментальные образцы вакцины против P. aeruginosa, а также
вакцины против грибковых патогенов Candida и Aspergillus.
Предлагаемый подход к решению поставленной задачи основан на использовании синтетических
олигосахаридов строго определенного строения, отвечающих структуре поверхностных углеводных
антигенов данных патогенных микроорганизмов, в качестве иммунологически активных углеводных
компонентов. Существующие в настоящее время углеводные вакцины имеют в своей основе
специфические углеводные структуры, как правило, полисахариды, локализованные на клеточной
поверхности патогенов. Технология получения вакцин на основе нативных полисахаридов имеет ряд
недостатков, связанных с трудностями культивирования бактерий и выделения, очистки и стандартизации
полисахаридов. Получение конъюгированных вакцин с использованием синтетических фрагментов
полисахаридов строго определенного строения лишено перечисленных недостатков.
Задача создания конъюгированных вакцин на основе синтетических углеводных лигандов строго
определенного строения включает в себя несколько подзадач. Первой из них является химический синтез
иммунологически активных олигосахаридных фрагментов полисахаридов. В случае бактерии P. aeruginosa
такими олигосахаридами будут фрагменты бактериального альгината, являющегося компонентом
биопленок – полимера бета-(1→4)-связанной маннуроновой кислоты. В рамках этой подзадачи будут
разработаны эффективные методы получения таких олигосахаридов. Другой целью химического синтеза
будет эффективное получение олигосахаридных лигандов, родственных фрагментам бета-(1→3)-глюкана –
общего углеводного антигена клеточной стенки патогенных грибков, включая Candida, Aspergillus и
других.
Вторым компонентом конъюгированных вакцин является белок-носитель. В рамках проекта
предполагается разработать генно-инженерный метод получения (в перспективе – создание
соответствующей технологии) белка-носителя, широко применяемого для создания конъюгированных
вакцинных препаратов – рекомбинантного дифтерийного анатоксина (CRM197).
Важным этапом является ковалентное присоединение (конъюгация) синтезированных углеводных
лигандов к белку-носителю. Методы конъюгации углеводных молекул с белками достаточно хорошо
разработаны и наиболее эффективные из них, в частности, основанные на использовании эфиров
квадратной кислоты в качестве сшивающих реагентов, будут использованы при выполнении данного
проекта.
Принципиальным этапом проекта будет иммунологическое исследование полученных конъюгированных
вакцинных препаратов на основе синтетических углеводных лигандов. На животных моделях будет
изучена иммуногенность конъюгатов, интенсивность и специфичность иммунного ответа и способность
индуцировать иммунный ответ, защищающий от бактериального заражения, то есть протективная
активность. Аналогичные исследования будут проведены с конъюгатами углеводных антигенов клеточной
поверхности патогенных грибов Candida и Aspergillus. По результатам иммунологических исследований
будет проведен отбор наиболее активных вакцинных кандидатов, а также при необходимости будет
скорректирована структура олигосахаридов в составе конъюгатов.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Результаты проекта предполагается использовать для доклинического исследования вакцинных препаратов и разработки технологии производства конъюгированных вакцин.
По результатам доклинических исследований будут отобраны кандидаты конъюгированных вакцин для последующих клинических исследований.
Разрабатываемые конъюгированные вакцинные препараты могут быть использованы для организации производства и медицинского применения на территории Российской Федерации.
За счет снижения стоимости препарата в сравнении с зарубежными аналогами ожидается улучшение лекарственного обеспечения, повышение качества оказания медицинской помощи и улучшение результатов лечения больных бактериальными и грибковыми госпитальными инфекционными заболеваниями, а также повышение их качества жизни.
Экономический эффект применения конъюгированных вакцинных препаратов предполагает сокращение сроков пребывания пациентов в стационаре, снижение уровня смертности от бактериальных и грибковых госпитальных инфекций и повышение качества жизни населения.

Текущие результаты проекта:
Подготовлен аналитический обзор информационных источников. Показано, что белок CRM197, являющийся нетоксичным вариантом дифтерийного токсина, представляет собой перспективный адъювант нового поколения, который может быть успешно использован в вакцинных препаратах. В результате анализа научных информационных источников по синтезу бета-(1→3)-олигоглюкозидов выбраны оптимальные структуры гликозил-акцептора, начиная с которого происходит удлинение олигосахаридной цепи, и гликозил-донора, с помощью которого это удлинение осуществляется. Определен оптимальный набор O- и N-защитных групп, уходящей группы в гликозил-доноре и структуры гликозилируемой группировки.
Проведены патентные исследования в соответствии с ГОСТ Р15.011-96. Показано, что заявляемая тема охраноспособна.
Выполнена оценка генетической стабильности штамма E.coli - продуцента белка CRM197. На основании исследований сегрегационной и структурной стабильности плазмидной ДНК pС197 штамм-продуцент белка CRM197 признан генетически стабильным. Нуклеотидные замены, приводящие к нарушению репликативных способностей плазмиды, и мутации в экспрессирующих элементах не выявлены.
Изучены культуральные свойства штамма-продуцента белка CRM197 на основе клеток E.coli. Охарактеризовано таксономическое положение данного штамма, выявлено соответствие его биологических свойств признакам, присущим виду Escherichia coli.
Проведена оптимизация процесса культивирования штамма-продуцента белка CRM197. Определен уровень биосинтеза рекомбинантного белка CRM197, составляющий 23% от общего клеточного белка.
Разработан метод синтеза спейсерированных бета-(1→3)-олигоглюкозидов различной длины, включающих 3, 5 и 7 моносахаридных звеньев. С использованием этого метода синтезированы бета-(1→3)-олигоглюкозиды, содержащие 3, 5 и 7 моносахаридных звеньев. Строение полученных продуктов надежно доказано методами спектроскопии ЯМР на ядрах 1Н и 13С и масс-спектрометрии высокого разрешения. Синтезированные олигоглюкозиды строго соответствуют по своей структуре фрагментам грибкового бета-(1→3)-глюкана, а их чистота по данным 1Н ЯМР составляет не менее 97%.
Разработан метод очистки рекомбинантного CRM197 из клеток штамма-продуцента E.coli BL21 и рефолдинга рекомбинантного белка с использованием ионообменной, гидрофобной и молекулярно-ситовой хроматографии.
Разработан метод определения подлинности рекомбинантного белка CRM197 с помощью косвенного неконкурентного метода ИФА, с использованием специфически реагирующих антител Anti-Diphteriatoxin antibody кат. № ab151222, Abcam, UK. Данный метод позволяет исключить этапы, связанные с конъюгацией специфических антител с ферментативной меткой (пероксидазой хрена), что существенно сокращает время проведения анализа и делает его наименее трудоемким.
Разработаны методы синтеза спейсерированных бета-(1→3)-олигоглюкозидов различной длины, включающих 9, 11 и 13 моносахаридных звеньев, и спейсерированных бета-(1→4)-олигоманнуронозидов различной длины, включающих 3, 5 и 7 моносахаридных звеньев. Строение полученных продуктов надежно доказано методами спектроскопии ЯМР на ядрах 1Н и 13С и масс-спектрометрии высокого разрешения. Синтезированные олигоглюкозиды и олигоманнуронозиды по своей структуре строго соответствуют фрагментам грибкового бета-(1→3)-глюкана и фрагментам бактериальных альгиновых кислот, соответственно, а их чистота по данным 1Н ЯМР составляет не менее 97%.
Получен рекомбинантный белок CRM197 и изучены его физико-химические свойства.
Выполнен синтез и характеристика олигосахаридных лигандов для получения конъюгатов с белком-носителем CRM197.
Разработан метод синтеза покрывающих антигенов для оценки эффективности и специфичности иммунного ответа с использованием иммуноферментного анализа.
Проведен контроль качества рекомбинантного белка CRM197: чистоты (содержание белка и ДНК штамма-продуцента, бактериальных эндотоксинов), аномальной токсичности.
Выполнен контроль качества полученных олигосахаридных лигандов.
Проведен третий этап работ по организации экспериментального производства и контроля качества конъюгированных вакцин на базе ЗАО «Р-Фарм».