Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка аналитической тест-системы на основе анализа уровня микроРНК в плазме крови для малоинвазивной диагностики рака предстательной железы

Номер контракта: 14.579.21.0054

Руководитель: Саматов Тимур Рустемович

Должность руководителя: старший научный сотрудник

Докладчик: Саматов Тимур Рустэмович, старший научный сотрудник

Аннотация скачать
Постер скачать
Презентация скачать
Ключевые слова:
рак предстательной железы, микрорнк, плазма, малоинвазивная диагностика

Цель проекта:
Рак предстательной железы (РПЖ) является вторым по частоте и пятым по смертности среди злокачественных новообразований у мужчин в мире [Siegel, Naishadham, Jemal, 2013]. Одной из важных клинических проблем является вопрос дифференциальной диагностики простатита, доброкачественная гиперплазия предстательной железы (ДГПЖ) и РПЖ. Простатит, проявляющийся в воспалении предстательной железы, является наиболее часто диагностируемым урологическим заболеванием у мужчин до 50 лет и третьим – после 50 лет [Lokant, Naz, 2014]. ДГПЖ также является распространенным заболеванием, проявляющимся в увеличение размера предстательной железы, что может оказывать значительное влияние на здоровье больного и требовать хирургического лечения при невосприимчивости к лекарственной терапии. ДГПЖ может развиваться и в 25 лет, однако гистологическое подтверждение чаще всего обнаруживается в возрасте примерно 50 лет, когда частота развития заболевания достигает 50% [Lokant, Naz, 2014]. Ранняя дифференциальная диагностика ДГПЖ и РПЖ является очень важным моментом в плане улучшения исходов и выживаемости при РПЖ. Текущая скрининговая диагностика РПЖ включает метод ректального пальцевого исследования с чувствительностью около 37% [Schroder и др., 1998], определение ПСА, уровень которого повышен как при РПЖ, так и при ДГПЖ, делая дифференциальную диагностику относительно сложным процессом, особенно при значениях ПСА из «серой зоны» 4–10 нг/мл [Woolf, 2001]. Еще одним способом диагностики РПЖ является трансректальная биопсия под контролем ультразвука, однако данная методика имеет ограничения, связанные с техникой получения образцов, что в результате не позволяет обнаружить около 20% случаев РПЖ при первой процедуре [Djavan и др., 2001]. Кроме того, определенные области предстательной железы, такие как её передняя часть, в которой развивается более 25% опухолей, остаются сложнодоступными для трансректальной биопсии [Lawrentschuk и др., 2010]. Инвазивность процедуры остро ставит вопрос ранней дифференциальной диагностики ДГПЖ и РПЖ для решения о необходимости проведения первичной биопсии. В свете вышесказанного становится актуальным поиск новых маркеров диагностики РПЖ, а также для оценки течения болезни. Перспективным направлением развития диагностики РПЖ являются циркулирующие молекулы микроРНК. Данные некодирующие молекулы РНК выступают в роли посттрансляционных регуляторов, изменяя в конечном итоге экспрессию определенных генов [Nicoloso и др., 2009]. Существует множество подтверждений, что микроРНК могут быть гипер- или гипоэкспрессированы в различных злокачественных опухолях ([Heneghan, Miller, Kerin, 2010]. Данные молекулы могут быть выделены из любых биологических жидкостей и определены даже при наличии в очень малых количествах, что делает их перспективными биомаркерами [Cortez и др., 2011]. При РПЖ микроРНК могут выступать в роли биомаркеров в диагностике и прогнозе течения РПЖ. Первично было обнаружено, что miR-141 может определять наличие распространенного, метастатического РПЖ при сравнении со здоровым контролем с чувствительностью 60% и специфичностью 100% [Mitchell и др., 2008]. При сравнении локализованного РПЖ с метастатической формой специфичность определения miR-141 оказалась ниже 100%, параллельно были выявлены две микроРНК, отличавшие раннюю стадию болезни от здорового контроля [Yaman Agaoglu и др., 2011]. Еще одно исследование обнаружило в результате микрочипового анализа 15 микроРНК, повышенных при РПЖ, но данные молекулы не позволяли достоверно отличить РПЖ от других типов рака [Lodes и др., 2009]. Было показано, что в крови мужчин при РПЖ изменена концентрация 12 определенных микроРНК [Bryant и др., 2012], другое исследование выявило панель из пяти микроРНК, отличающих РПЖ от ДГПЖ [Chen и др., 2012]. Еще три микроРНК позволяли дифференцировать раннюю стадию РПЖ и ДГПЖ, однако не различались при РПЖ и нормальном здоровье [Mahn и др., 2011]. МикроРНК при РПЖ могут выступать не только в качестве диагностических маркеров, но и как прогностические предикторы. При сравнении распространенной формы РПЖ с локализованной изначально было обнаружено 3 микроРНК, связанных с более высокой стадией и суммой Глисона [Brase и др., 2011], затем к ним добавились еще 15 микроРНК [Bryant и др., 2012; Yaman Agaoglu и др., 2011]. При сравнении со шкалой CAPRA при увеличении количества баллов по последней обнаружилось уменьшение miR-24 и повышение miR-106a, miR-451, miR-20a, miR-21 и miR-93 [Moltzahn и др., 2011; Shen и др., 2012]. МикроРНК также выступают в роли вероятных предикторов ответа на терапию при РПЖ. Например, разница в уровнях miR-21 у пациентов с РПЖ отличала восприимчивость опухоли к доцетакселу и была выше при кастрационно-резистентном РПЖ [Zhang и др., 2011]. Концентрация miR-141 предсказывала прогрессию РПЖ с чувствительностью 78,9%, как и уровень ПСА, а специфичность для miR-141 и ПСА составила соответственно 68,8% и 87,4% [Gonzales и др., 2011]. Не смотря на то, что на сегодняшний день удалось продемонстрировать диагностическую значимость ряда циркулирующих в крови микроРНК, надежная методика для применения в практической медицине не создана. Отсутствует общепринятая методика получения плазмы крови для последующего выделения микроРНК, крайне ограничен объем клинических данных о связи микроРНК и РПЖ, не разработаны панели референсных генов для нормализации результатов [Sita-Lumsden и др., 2013]. Маловероятно, что определение конкретной одиночной микроРНК позволит достичь достаточной диагностической и прогностической точности, так как существуют сообщения о связи одних и тех же типов микроРНК с различными типами опухолей. Одним из путей решения вышеперечисленных проблем может быть проведение исследований, направленных на поиск новых диагностически-значимых микроРНК с последующим созданием панели из нескольких микроРНК, способных удовлетворить задачи диагностики и прогнозирования РПЖ, как это было сделано для рака поджелудочной железы [Szafranska-Schwarzbach и др., 2011]. Таким образом, проект направлен на решение актуальной научной проблемы – разработки набора реагентов для диагностики рака предстательной железы и прогноза чувствительности к доцетакселу при гормонорезистентном раке предстательной железы на основе определения уровня пула циркулирующих в плазме крови микроРНК методом полимеразной цепной реакции в реальном времени. Цели проекта: 1) Создать аналитическую тест-систему на основе определения уровня циркулирующих в плазме крови микроРНК методом количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР) для диагностики рака предстательной железы и прогноза чувствительности к доцетакселу при гормонорезистентном раке предстательной железы. 2) Разработать программное обеспечение (ПО) для электронно-вычислительной машины (ЭВМ), позволяющую интерпретировать результаты работы аналитической тест-системы, в том числе позволять диагностировать рак предстательной железы и прогнозировать чувствительность опухоли к доцетакселу при гормонорезистентном раке предстательной железы.

Основные планируемые результаты проекта:
Основным результатом реализации проекта станет создание аналитической тест-системы, позволяющей осуществлять дифференциальную диагностику следующих состояний по анализу представленности 20 микроРНК в плазме крови пациентов:
доброкачественная гиперплазия предстательной железы и рак предстательной железы;
неметастатическая форма рака предстательной железы и метастатическая форма рака предстательной железы;
метастатическая форма рака предстательной железы и гормонорезистентная форма рака предстательной железы, а также
оценить чувствительность гормонорезистентной формы рака предстательной железы к терапии доцетакселом.

Основные характеристики тест-системы:
Формат теста – кПЦР;
Тип аналита - микроРНК;
Количество биоматериала на один анализ – не более 2 мл плазмы крови;
Время выполнения анализа – не более 3 часов;
Время подготовки проб к анализу – не более 5 часов;
Коэффициент вариации результатов измерений в технических повторах, CV – не более 30%.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
Основными Научно-техническими результатами ПНИ будут:
- результаты патентных исследований;
- методика получения плазмы крови, позволяющую минимизировать выход нуклеиновых кислот из форменных элементов крови.
- математическая модель, позволяющая диагностировать рак предстательной железы, а также определять чувствительность к доцетакселу гормонорезистентного рака предстательной железы, по уровню циркулирующих в плазме крови человека микроРНК.
- программа для ЭВМ, позволяющая диагностировать рак предстательной железы, а также определять чувствительность к доцетакселу гормонорезистентного рака предстательной железы, по уровню циркулирующих в плазме крови человека микроРНК и референсных молекул, определенных методом ПЦР- РВ.
- экспериментальные образцы набора реагентов для оценки уровня микроРНК в плазме крови.
- проект технического задания на проведение ОКР «Разработка многопараметрической диагностической тест-системы для диагностики рака предстательной железы и персонифицированного выбора химиотерапии»;
- рекомендации по реализации результатов ПНИ в реальных секторах экономики.

Высокопроизводительный анализ миРНома осуществлялся на платформе Scanner 3000 7G (Affymetrix, США) с помощью чипов высокой плотности для анализа миРНома (GeneChip miRNA 4.0 Array).
Методика оценки уровня микроРНК разработана на основе одного PolyA-tail и SYBR Green.
В рамках доклинической валидации аналитической тест-системы используются ксенографтные модели рака предстательной железы (клеточные линии PC3, DU145, ARCaP).
В рамках разработки математической модели для аналитической тест системы использован способ повышения достоверности классификации за счет метода отбора транскриптов, позволивший снизить количество транскриптов благодаря оптимизации совокупной информативности результирующего набора вместо использования ранжирования по индивидуальной информативности. Следует отметить, что при этом для настройки классификатора был использован более мощный по сравнению с традиционно используемыми центроидами аппарат SVM (метод опорных векторов).
Ключевыми отличиями использованного нами метода от существующих аналогов являются оптимизация совокупной информативности набора транскриптов вместо использования транскриптов с наибольшей индивидуальной информативностью, а также ослабление эвристик / увеличении числа реализаций в методах типа Монте Карло, используемых при отборе набора транскриптов. Для построения эффективных алгоритмов построения тест-системы определены функционалы, формализующие понятие совокупной информативности набора транскриптов, предложены подходы к их оптимизации, а также проанализированы возможные методы машинного обучения, которые будут использоваться для построения классификаторов. Кроме этого, разработан аппарат для сопоставления эффективности (достоверности) тест-систем с общим назначением.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Результаты ПНИ предназначены для применения в лабораторной диагностике рака предстательной железы (РПЖ), персонифицированного лечения гормонорезистентной формы РПЖ.
После завершения необходимого объема клинических испытаний разработанная аналитическая тест-система станет методом выбора для малоинвазивной диагностики РПЖ, сможет заменить травматичную процедуру биопсии предстательной железы.

Планируется следующая этапность действий по доведению до потребителя ожидаемых результатов:
1) Заявителем в ходе выполнения проекта будет создана интеллектуальная собственность (изобретения, защищенные патентами РФ), проведена оценка ее рыночной стоимости, поставлена на баланс в виде амортизируемых нематериальных активов;
2) По завершению проекта Заявитель планирует организовать экспертную оценку информативности разработанных методик на базе профильных национальных испытательных центров, инициировать вопрос о придании им статуса нормативных национальных методик, обеспечить регистрацию аналитической тест- системы в качестве изделия медицинского назначения;
3) В ходе выполнения проекта будут организованы международные испытания информативности разработанной аналитической тест-системы;
4) Индустриальным партнером после завершения проекта планируется заключение лицензионных соглашений на право использования результатов интеллектуальной деятельности (РИД) Исполнителя, организация опытного производства аналитической тест-системы.

Текущие результаты проекта:
Выполнен обзор и анализ современной научно-технической, нормативной, методической литературы в области научно-технической проблемы, исследуемой в рамках ПНИ. Проведены патентные исследования. Осуществлена экспериментальная разработка методики получения плазмы крови, позволяющая минимизировать выход нуклеиновых кислот из форменных элементов крови.
Создана коллекция плазмы крови пациентов. Проведено сравнительное исследование протоколов выделения циркулирующих в плазме крови микроРНК. Проведен выбор оптимального протокола выделения микроРНК. Выполнен мультиплексный анализ микроРНК в сформированной коллекции образцов плазмы крови на микрочипах высокой плотности GeneChip miRNA 4.0 Array (часть 1).

Разработаны варианты технических решений ДР. Разработаны программы и методики испытаний экспериментальных образцов ДР. Изготовлены экспериментальные образцы ДР. Проведены исследовательские испытания экспериментальных образцов ДР.

Выполнен биоинформационный анализ результатов мультиплексного анализа микроРНК. Выбраны значимые для диагностики рака предстательной железы и прогноза чувствительности к доцетакселу при гормонорезистентном раке предстательной железы микроРНК.
Разработана математическая модель, позволяющая диагностировать рак предстательной железы, а также определять чувствительность к доцетакселу гормонорезистентного рака предстательной железы, по уровню циркулирующих в плазме крови человека микроРНК. Разработана программная документации стадии технический проект.
Экспериментально обоснованы референсные молекулы для нормировки уровня микроРНК в плазме крови. Разработаны и изготовлены варианты технических решений КО и СР, разработаны программы и методики испытаний экспериментальных образцов КО и СР. Проведены испытания КО и СР.