Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка методов, технологий и платформ для исследований функционирования нервных систем на основе создания высокоразрешающей информационной модели кортикальных структур мозга

Номер контракта: 14.581.21.0016

Руководитель: Семьянов Алексей Васильевич

Должность руководителя: Профессор

Докладчик: Мухина Ирина Васильевна, Руководитель центра развития биотехнологий ННГУ им. Н.И Лобачевского, профессор кафедры нейротехнологий ННГУ им. Н.И. Лобачевского

Организация: федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И.Лобачевского"
Организация докладчика: федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Нижегородский государственный университет им. Н.И.Лобачевского"

Аннотация скачать
Постер скачать
Презентация скачать
Ключевые слова:
кортикальная колонка мозга, нейрон-глиальное взаимодействие, 3d атлас, по для 3d атласа, экспериментальные образцы трехмерной нейроглиальной культуры клеток, экспериментальные образцы набора реагентов для трансфекции астроцитов

Цель проекта:
1. Проект направлен на решение фундаментальной проблемы современной науки о мозге - выявление механизмов и принципов работы мозга, лежащих в основе формирования когнитивных функций: обучения, памяти, восприятия, распознавания, моторных реакций. 2. Цель проекта - разработка высокоразрешающей информационной модели кортикальных структур мозга, представляющей собой программный комплекс «3D Атлас нейроглии кортикальных колонок мозга крысы / мыши», способной заложить основу трансляционных исследований в области функционирования центральной нервной системы млекопитающих (нейробиологических, фармакологических, токсикологических и иных исследований), а также базу для формирования нового класса стратегических технологий – искусственных когнитивных систем.

Основные планируемые результаты проекта:
1. Для достижения поставленной цели будут получены следующие основные результаты:

Будет разработан программный комплекс «3D Атлас нейроглии кортикальных колонок мозга крысы / мыши» на основе сверхбольшого
высокодоступного цифрового каталога, содержащего структурные (архитектурные), функциональные (молекулярные) данные, а также результаты исследований аллокации новой когнитивной информации в нейроны кортикальной колонки мозга крысы / мыши (выполняемых в рамках ПНИ-1 «Разработка модели распознавания и фиксации новой информации в кортикальной микроколонке»).

Будут созданы генноинженерные (оптогенетические и др.) конструкции для специфического мечения астроцитов в кортикальных колонках мозга крысы / мыши.

Будет разработана методика для определения роли астроцитов в синапсе, в частности, в процессе передачи нервного импульса (построение астроконнектома), и симуляции синапса и его физиологической активности с применением программного обеспечения и алгоритмов, обеспечивающих моделирование передачи нервного импульса в сверхбольших нейроглиальных сетях (разрабатываемых в рамках ПНИ-2 «Разработка технологий для репрезентации функций кортикальных структур in silico»).

Будет разработана методика формирования трехмерной нейроглиальной культуры клеток с возможностью формирования полноценных синапсов in vitro и получены экспериментальные образцы трехмерных культур.

Будут разработаны методы исследования функционирования нервных систем на основе разработанного 3D Атласа.

2. 3D Атлас будет включать в себя программное обеспечение для создания 3D-анимации, предназначенное для обеспечения возможности 3D реконструкции анатомических структур (нейронов и глиальных клеток) посредством наложения оптических срезов и симуляции синаптической передачи в 3D Атласе. Технические характеристики аппаратного обеспечения 3D Атласа указаны в Техническом задании (приложение 1 к Соглашению о получении субсидии № 14.581.21.0016). Программный комплекс будет совместим с операционными системами Linux, Windows и будет позволять проводить масштабирование объекта визуализации до уровня единичной клетки (нейрон, астроцит), трансформирование 3D объекта (перемещение, вращение); симуляцию и визуализацию синаптической передачи во времени. Также в состав 3D Атласа будет входить программное обеспечение для интеграции экспериментальных данных, позволяющее интегрировать в 3D Атлас структурные и функциональные (молекулярные) данные, а также данных об аллокации новой когнитивной информации в нейроны кортикальной колонки мозга крысы / мыши.

Генноинженерные (оптогенетические, хемогенетические и др.) конструкции для специфического мечения астроцитов в кортикальных колонках мозга крысы / мыши будут представлять собой экспериментальный образец набора реактивов для трансфекции астроцитов, предназначенный для специфического мечения и активирования / ингибирования внутриклеточных каскадов астроцитов в кортикальных колонках мозга крысы / мыши. Будут использованы ленти- / аденоассоциированные/ аденовирусные векторы, специфичные к астроцитам, не токсичные для клеток нервной системы. Количество индуцируемых внутриклеточных каскадов (α- и β-адренергические / пуринергические / G-белок зависимые сигнальные каскады) составит не менее трех.

Разработанная при выполнении проекта методика формирования трехмерной нейроглиальной культуры клеток будет предусматривать получение пористых структур (скаффолдов) заданной архитектоники посредством инициации процесса двухфотонной полимеризации с использованием в качестве реакционные системы модифицированного хитозана. Структура скаффолда представляет собой цилиндры c заданными линейными размерами (ширина стенок от 20 до 50 мкм, диаметр отверстия от 60 до 100 мкм, высота от 100 до 150 мкм) и значениями модуля Юнга от 50 до 500 Мпа. Методика будет обеспечивать получение диссоциированных клеток мозга для дальнейшего их культивирования и формирования трехмерной культуры клеток на скаффолде, что позволит изучить морфологические параметры нейрон-глиальных сетей, сформированных на скаффолдах и процессы синаптогенеза. Типы культивируемых клеток – кортикальные нейроны и глия; соотношение нейронов и глии в культуре – близкое к соотношению количества нейронов и клеток глии в коре головного мозга in vivo – от 1:5 до 1:10 соответственно; минимальная плотность клеток в трехмерной культуре – не менее 1 млн. клеток/см3.

Методика определения роли астроцитов в синапсе и симуляции синапса и его физиологической активности будет предназначена для моделирования и компьютерной симуляции процесса передачи нервного импульса между нейронами с учётом влияния астроцита и представляет собой математическию модель, содержащую не менее двух уравнений, описывающих динамику нейронов; не менее двух уравнений, описывающих динамику астроцитов, не менее двух уравнений, описывающих динамику синапсов и позволяющую учитывать не менее семи различных параметров, влияющих на динамику синапса и не менее семи различных параметров, влияющих изменение внутриклеточных каскадов астроцитов.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
3D Атлас представляет собой цифровой каталог, содержащий структурные (архитектурные), функциональные данные об организации кортикальных микроколонок мозга крысы / мыши. Разрабатываемый 3D Атлас будет включать:
− программное обеспечение для создания 3D-анимации на основе математической модели обработки сигналов в нейронах и глиальных клетках
(астроцитах) и экспериментального образца программного обеспечения, обеспечивающих компьютерное моделирование передачи нервной активности в сверхбольших нейро-глиальных сетях кортикальных структур головного мозга (ПНИ-2 «Разработка технологий для репрезентации функций кортикальных структур in silico»);

− программное обеспечение для интеграции экспериментальных данных в 3D Атлас;

− программное обеспечение для создания пользовательского интерфейса;

− сверхбольшой высокодоступный цифровой каталог данных.

Создание 3D Атласа нейроглии кортикальных колонок мозга крысы/мыши позволит проводить исследования функционирования головного мозга с помощью симуляции функционирования мозга с использованием возможностей высокопроизводительных вычислений и современных суперкомпьютеров и выявить механизмы и принципы работы мозга, лежащих в основе формирования когнитивных функций.

2. Используемые подходы, основанные на совмещении высокоинформативных классических методов иммуногистохимических, электронномикроскопических исследований, кальциевого имиджинга с современными 3D технологиями пространственной реконструкции биологических структур, являются передовыми и позволят исследовать морфофункциональный профиль и взаимосвязи нейронов и астроцитов в нейрон-глиальных сетях кортикальной микроколонки головного мозга крысы / мыши.

Изучение нейротрансмиттерных профилей клеток мозга связано с получением принципиально новых данных о процессах фиксации и обработки информации в мозге.

Создание генноинженерных (в том числе оптогенетических конструктов) для исследования изменений в адренергических, пуринергических и G- белок зависимых рецепторах и их сигнальных путях позволит исследовать сигнальные астроцитарные каскады с помощью новейших методик и получить уникальные данные о функционировании нервных клеток.

Разработка новой технологии создания трехмерных культур нервных клеток на биодеградируемых матриксах позволит исследовать процессы формирования синапсов in vitro, а также создать стратегии для применения матриксов для целей заместительной нейротрансплантологии, что способствует формированию нового терапевтического направления и обеспечит лидерство России в данной области

3. В настоящее время исследовательские центры вычислительной нейронауки привлекают существенные инвестиции со стороны правительства и частных фондов, особенно в США (Центр Слоан-Шварц вычислительной нейронауки в Гарварде, Принстоне, Колумбии, Универитете Нью-Йорка и других ведущих университетов) и Германии (Центр Бернштейна вычислительной нейронауки, располагающийся в Берлине, Мюнхене, Геттингеме и Гейдельберге). Следует также указать ведущие мировые проекты по крупномасштабному моделированию структур и функций нейронных систем мозга, такие как The Human Brain Project, The Brain Corporation, SyNAPSE, The BRAIN Initiative.
Перечисленные конкуренты, безусловно, являются мировыми лидерами в области изучения функционирования мозга и вычислительной нейронауки. Их цели и задачи соответствуют современным тенденциям и имеют свою специфику, например, создание детализированной модели мозга человека (The Human Brain Project) или создание электронного чипа, воспроизводящего функции определённой области мозга (The Brain Corporation). Проводимые исследования являются новыми и оригинальными как в плане постановки задач, так и в плане применения комплексного подхода к их решению с помощью математического и компьютерного моделирования и комплекса экспериментальных исследований для разработки 3D Атласа кортикальной колонки головного мозга крысы / мыши.

Результаты проекта о структурно-функциональных данных об организации кортикальных микроколонок мозга крысы / мыши будут являться принципиально новыми и соответствовать мировому уровню. Результаты, полученные в ходе выполнения проекта, будут интегрированы в мировую науку для обеспечения фундаментального задела для разработки нового класса вычислительных устройств и технологий, а также поиска способов лечения нейродегенеративных заболеваний, что обеспечивает фундамент для общего развития с прицелом на последующую
интеграцию в совместные с мировыми лидерами проекты.

4. Для достижения сформулированных в проекте целей будет проведены комплексные морфофункциональные исследования нейрон-глиальных сетей мозга с привлечением современных высокотехнологических методов и новых решений.

К основным путям достижения результатов относятся:

Проведение теоретических и анатомических исследований нервных и глиальных компонентов кортикальной микроколонки и составляющих её слоёв. Методами иммуногистохимического окрашивания будет охарактеризовано соотношение нейронов и глиальных клеток. Для изучения ультраструктуры астроцитарных компартментов будут проведены электромикроскопические исследования с применением метода послойного сканирования и последующей трехмерной реконструкции. Будет проведен анализ полученных изображений функционально значимых компартментов нервных клеток. В результате будет создана трёхмерная модель функционального профиля астроцитов головного мозга с учетом морфологии отдельных компартментов.

Будут проведены проведены экспериментальные исследования физиологической активности астроцитов в кортикальных колонках посредством измерения активности Ca2+-зависимых внутриклеточных сигнальных каскадов с применением флуоресцентного кальциевого индикатора. Данный метод позволяет оценить вклад отдельных астроцитов и их функциональных конгломератов в модуляции нейросетевой активности.

Будет проведена оценка кальциевой активности астроцитов в физиологическом состоянии и при частичном блокировании внутриклеточных сигнальных каскадов посредством добавления антагонистов различных рецепторов. Детектирование изменения во флуоресценции кальций-зависимых красителей в астроцитах будет осуществлено с помощью флуоресцентный лазерной сканирующей микроскопии.

Будут исследованы нейро-, глиотрансмиттерных и рецепторных профилей клеток мозга. Для реализации данной задачи необходимо проведения иммуноцитохимического анализа клеток с использованием антител к маркерам различных типов нейронов. Визуализация полученных данных будет проведена с использованием методов лазерной сканирующей микроскопии, что позволит детализировать локализацию изучаемых молекулярных маркеров на субклеточном уровне и выявить особенности цитоархетиктоники функционально связанных клеточных ансамблей.

Будет разработан экспериментальный образец набора реагентов для трансфекции астроцитов на основе вирусных векторов, предназначенных для специфического маркирования и функционального воздействия (активирования или ингибирования) на внутриклеточные каскады астроцитов мозга мыши. В качестве векторов для трансфекции будут подобраны типы вирусов, максимально подходящие для конкретного типа маркируемых клеток (аденоассоциированные/ленти/аденовирусные системы), что позволит решить проблему тканевой и видовой тропности вирусного вектора. Будет проведено исследование изменений в α1, α2, β1, β2 и β3-адренергических, P1 и P2Y пуринергических G- белок зависимых рецепторах и их сигнальных путях (cAMP, транслокация аррестина, внутриклеточный Ca2+) in vitro в трансфецированных генетическими конструкциями клетках. С помощью методик биоимиджинга, в том числе иммуногистохимии, будут исследованы структуры межастроцитарных связей в кортикальных колонках мозга крысы / мыши. Применение сканирующей лазерной микроскопии позволит получить изображения с клеточным и субклеточным разрешением.

Будет разработана методика создания трехмерной нейроглиальной культуры клеток на основе биодеградируемых матриксов с заданной архитектоникой. Планируется исследовать возможность использования созданных матриксов-носителей для нейротрансплантации. Для решения данной задачи необходимо не только создание биодеградируемых матриксов-носителей, но и изучение процессов формирования полноценных синапсов in vitro. Трехмерные структуры планируется получать одним из следующих методов: сверхкритическое вспенивание или микростереолитография. Получаемые такими методами структуры являются совместимыми с клетками нервной системы. Будет разработан экспериментальный образец ТНКК и проведены исследовательских испытаний данных образцов, включающие оценку формирования
полноценных в функциональном отношении нейрон-глиальных сетей.

Для изучения процессов передачи сигналов в нейронных сетях мозга при учете воздействия глии будет разработана новая математическая модель. В модель будут включены параметры морфологических и архитектурных особенностей нейронов кортикальных колонок мозга. Модель позволит предсказать функциональную роль астроцитов в синаптической передаче сигналов в мозге. Математическое описание будет разрабатываться с учётом феноменологического подхода. Будут использованы методы нелинейной динамики и бифуркационного анализа для исследования динамических режимов моделей и оценки значений параметров. Компьютерные модели будут реализованы с применением численных методов, расчёты будут проводиться с использованием параллельных вычислений.

В результате выполнения всех теоретических и экспериментальных задач проекта будет разработан 3D атлас нейрон-глиальных сетей головного мозга, в частности неокортекса, на основе полученных экспериментальных данным и созданных виртуальных моделей.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
1. Область применения 3D Атласа – биомедицинские исследования и разработки в области изучения мозга. Основной результат проекта может применяться при симуляциях функционирования мозга с использованием возможностей высокопроизводительных вычислений и современных суперкомпьютеров. Применение разрабатываемого продукта возможно как при проведении фундаментальных нейробиологических исследований, так при разработке новых терапевтических стратегий при коррекции различных заболеваний нервной системы.

Разработанная в ходе выполнения проекта методика создания трехмерных нейрональных культур на пористых полимерных матрицах может в дальнейшем применяться в клинической медицине, а именно нейрохирургии. Методика может быть применена для создания заместительной нейротрансплантации при травмах и плановых операциях.

Разработанные в ходе выполнения проекта генноинженерные конструкты для маркирования астроцитов и исследования внутриклеточных сигнальных каскадов могут быть использованы научным сообшеством для проведения фундаментальных и прикладных работ в области биологии и, в первую очередь, исследовательскими центрами, проводящими исследования в различных областях нейробиологии и биомедицины.

2. Будет обеспечено внедрение (промышленное освоение) результатов ПНИЭР данного проекта посредством организации серийного производства продуктов: (а) 3D атлас с цифровым каталогом; (б) инновационная система обработки, записи, хранения и считывания данных, реализуемая на принципах нейросетевой организации мозга, в том числе микроколонки; (в) интерактивная цитоархитектоническая модель нейрон-глиальных сетей мозга для преклинических исследований в виде комплекса программных продуктов; (г) программно- аппаратный модуль обработки персонализированных данных, направленный на пациент-специфичные методы прогнозирования развития и коррекции нейродегенеративных заболеваний.

Между Участником конкурса и Индустриальным партнером имеются согласованные документы, такие как техническое задание, план-график исполнения обязательств и другие. Для организации серийного производства Продукта Индустриальный партнер ООО "НИАГАРА КОМПЬЮТЕРС" имеет договор долгосрочного сотрудничества с ЗАО "ДОК-2000" г. Электросталь Московской области, по которому Индустриальному партнеру предоставляются производственные мощности. Также Индустриальный партнер имеет сервисный центр, осуществляющий техническое обслуживание серверов и программно-аппаратных комплексов.

3. Исследование строения и принципов функционирования головного мозга в настоящее время требует применения комплексного междисциплинарного подхода, использования передовых методик, которые являются дорогостоящими и ресурсоёмкими.

3D Атлас будет позволять осуществлять симуляцию экспериментов – моделирование активирования/ингибирования астроцитарных внутриклеточных каскадов (α- и β-адренергических / пуринергических / G-белок зависимых), моделирование функционального ответа нейронов, симуляцию синапса и его физиологической активности с применением программного обеспечения и алгоритмов, обеспечивающих моделирование передачи нервного импульса в сверхбольших нейроглиальных сетях (разрабатываемых в рамках ПНИ-2 «Разработка технологий для репрезентации функций кортикальных структур in silico»).

Это позволит снизить суммарные затраты на проведение экспериментальные исследования в области нейробиологии и биомедицины, а также обеспечит развитие в России отрасли разработки наукоёмких программных продуктов и высокопроизводительных вычислений для научных задач. Данный проект безусловно станет важным шагом в развитии исследований мозга в России.

4. Исследования мозга являются одним из ведущих направлений мировой науки. Результаты данного проекта будут крайне востребованы мировым научным сообществом, в частности европейским консорциумом ExtraBrain (http://www.extrabrainitn.eu), международным консорциумом The Human Brain Project (https://www.humanbrainproject.eu/). Выполнение проекта позволит развить международное научное сотрудничество и усилить обмен опытом и новыми научными идеями, интегрировать российскую нейронауку в мировое научное сообщество, повысить конкурентоспособность России в нейробиологии и медицине.

При выполнении проекта будут реализованы мероприятия по демонстрации полученных результатов и популяризации науки, в том числе:
- Публикация научных статей с описанием результатов, методов и технологий, которые будут получены при исследованиях функционирования кортикальных структур мозга.
- Написание учебно-методических работ с описанием разработанных методик.
- Участие членов творческого коллектива в семинарах, симпозиумах, выставках, конференциях, в том числе международных.
- Создание специализированного сайта в сети Интернет, посвященного проводимым работам.
- Размещение информации о ходе выполнения проекта на официальном сайте Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского.

Текущие результаты проекта:
В настоящее время в соответствии с планом-графиком проводится анализ современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей научно-техническую проблему, исследуемую в рамках ПНИЭР и патентные исследования.

Выполняется выбор и обоснование направления исследований, в том числе:

- Проработка вариантов возможных решений задачи;

- Сравнительная оценка эффективности возможных направлений исследований;

- Выбор и обоснование оптимального варианта решения задачи.

Проводятся теоретические и анатомические исследования нервных и глиальных компонентов кортикальной микроколонки и составляющих её слоёв.

Проводятся экспериментальные исследования физиологической активности астроцитов в кортикальных колонках посредством измерения активности Ca2+-зависимых внутриклеточных сигнальных каскадов