Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка новых подходов в хранении биоматериалов медицинского и сельскохозяйственного назначения

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
чувствительные к обезвоживанию регуляторные элементы в геноме, генетические конструкции, безводное хранение белков и клеток, ангидробиоз, криохранение, защитные белки, трегалоза, хирономида, ооциты

Цель проекта:
Дизайн и создание комплекса генетических конструкций несущих регуляторные элементы генома ангидробиотического организма чувствительных к обезвоживанию. Разработка и оптимизация протоколов позволяющих осуществлять контролируемый медленным обезвоживанием синтез рекомбинантных белков в клетках Pv11 устойчивых к полному обезвоживанию. Создание научно-методических и нормативно-технических документов обеспечивающих эффективное использование полученных генетических конструкций для синтеза целевых чужеродных белков в Pv11 и хранение их в обезвоженном виде без потери биологических свойств. Создание комплекса генетических конструкций позволяющих контролируемый обезвоживанием (либо одним из сопутствующих ему факторов) синтез целевых белков и ферментов в ооцитах млекопитающих.

Основные планируемые результаты проекта:
В результате выполнения проекта на основе знаний о ангидробиозе будет создан научно-технический задел для внедрения новых подходов сохранения чувствительных к обезвоживанию белков в сухом виде без потери биологических функций, а также разработана и опробована методология увеличения стабильности клеток млекопитаю-щих при криохранении и хранении в условиях частичного обезвоживания. 1. Будут со-зданы генетические конструкции позволяющие инициировать экспрессию сразу нескольких целевых рекомбинантных белков в клетках медленным обезвоживанием без использования дополнительных химических реагентов. 2. Будет разработан и оптимизирован метод получения целевых белков в модельных ангидробиотических (способных выживать при полном обезвоживании) клетках, а также длительного хранения по-лученных белков в обезвоженном виде без потери биологической активности. 3. Будут выявлены конкретные стимулы ассоциированные с обезвоживанием (повышение концентрации соли, увеличение концентрации трегалозы, окислительный стресс), которые явяются непосредственным сигналом для активации промоторов под действием обезвоживания.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
1. Будут созданы генетические конструкции позволяющие инициировать экспрессию сразу нескольких
целевых рекомбинантных белков в клетках медленным обезвоживанием без использования
дополнительных химических реагентов.
2. Будет разработан и оптимизирован метод получения целевых белков в модельных ангидробиотических
(способных выживать при полном обезвоживании) клетках, а также длительного хранения полученных
белков в обезвоженном виде без потери биологической активности.
3. Будут выявлены конкретные стимулы ассоциированные с обезвоживанием (повышение концентрации
соли, увеличение концентрации трегалозы, окислительный стресс), которые явяются непосредственным
сигналом для активации промоторов под действием обезвоживания. На основе полученных данных, будут
усовершенствованы протоколы нетоксичной индукции синтеза целевых белков для их эффективного
применения в клетках млекопитающих.
4. Полученные генетические конструкции и оптмизированные протоколы безопасной индукции синтеза
белков будут применены для получения ооцитов млекопитающих (на модели свиных ооцитов)
содержащих эндогенно синтезированную трегалозу (естественный криопротектор), а также ряд защитных
белков, обеспечивающих выживание клеток при обезвоживании. Будет разработаны и опробированы
методики позволяющие значительно увеличить выживаемость и стабильность хранения ооцитов в
условиях криохранения и в условиях частичного обезвоживания без использования экзогенных токсичных
консервантов.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Получение эффективных способов безводного хранения белков биологическая активность которых теряется при классической лиофилизации является без-условно ожидаемым и востребованным в
современной медицине и биотехнологии. Так, методика получения, безводного хранения и быстрого выделения активных белков будет востребованна в диагно-стических системах медицинского назначения. Кроме того, методология найдет свое активное применение в мероприятиях по созданию био-банков , так как поз-волит многократно снизить затраты на хранение биологического материала, а в ряде случаев практически полностью исключить зависимость хранения важных белков от низких температурных энергозатратных систем. Протоколы синтеза защитных белков и трегалозы в ооцитах млекопитающих будут, без сомнений, широко востребованны в сельском хозяйстве и особенно в области сохранения генетического материла ценных пород домашних животных. Так, например, авторы проекта ожидают значительного прогресса в области прогресса в области хранения ооцитов, исключающего необходимость во внешних генотоксичных консервантах, что явится одним из важных шагов в создании более безопасных и энергосберегающих подходов в хранении биоматериала животноводческого назначения.
Полученные генетические конструкции и методики будут востребованны в первую биотехнологическими компаниями производящими диагностические системы на основе активных белков, а также фармацевтическими предприятиями. В перспективе методики повышения безопасности и эффективноти хранения клеток млекопитающих, и, особенно, в животноводстве, послужат основой для оптимизации технологии
хранения клеточного материала в соответствующих профильных биобанках регионального и федерального значения.

Текущие результаты проекта:
Получены и адаптированы к использованию линии клеток хирономиды Pv11 (Pv11- hi и Pv11-o), обладающие наибольшей устойчивостью к полному обезвоживанию в присутствии трегалозы - до 70% оживающих клеток. Совместный анализ литературных данных и данных генома хирономид показал наличие у хирономиды как минимум 20 участков генома содержащих чувствительных к обезвоживанию регуляторных генетических элементов. На следующем этапе проекта активность этих участков в клеточной культуре Pv11 была потверждена методами высокопроизводительного секвенирования и определены участки для использования для создания генетических конструкций. Проведен предварительная адаптация методов доставки типовых генетических конструкций в клетки Pv11. Результаты подтверждают, что клеточная культура с индуцируемым ангидробиозом может быть эффективно использована для экспрессии экзогенных конструкций.Проведен анализ транскриптомных данных секвенирования ангидробиотической хирономиды. Проведено секвенирование генома и транскриптома культуры клеток Pv11.Проведено выделение наиболее перспективных участков генома несущих двунаправленные регуляторные элементы. Созданы рабочие варианты генетических конструкций с промотороми из генома хирономиды