Регистрация / Вход
Прислать материал

Использование токсинов змеиных ядов, меченных функциональными наночастицами, для обнаружения эндогенных мишеней в клетках и тканях ex vivo с перспективой разработки новых диагностических и терапевтических средств.

Номер контракта: 14.584.21.0006

Руководитель: Уткин Юрий Николаевич

Должность: ведущий эксперт

Организация: федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский технологический университет "МИСиС"
Организация докладчика: федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Национальный исследовательский технологический университет "МИСиС"

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
конъюгат, токсин, альфа-нейротоксин, флуоресцентная наночастица, фактор роста нервов, никотиновый холинорецептор, trk a рецептор

Цель проекта:
Флуоресцентные метки широко используются в биологии и медицине. При использовании различных органических красителей в качестве флуоресцентных меток был выявлен ряд недостатков, в частности, необходимость использования различных красителей для получения каждого цвета и подбора соответствующей длины волны лазера для индукции флуоресценции этих красителей. Кроме того, цвета флуоресцентных меток часто сливаются и быстро бледнеют. Заменой традиционных органических и неорганических люминофоров служат полупроводниковые нанокристаллы. Используемые в качестве флуоресцентных меток, они лишены этих недостатков, обеспечивают сигнал, многократно превосходящий по яркости флуоресценции, используемые в настоящее время красители и более фотостабильны. При возбуждении они дают палитру четких цветов, а квантовый выход может достигать 70-80%, а сами нанокристаллы могут быть конъюгированы с биомолекулами. Применение полупроводниковых нанокристаллов может существенно расширить возможности визуализации многих биологических процессов. Они могут быть использованы, например, для визуализации рецепторных молекул и маркеров заболеваний. Имеется целый ряд токсинов животных ядов, избирательно и эффективно взаимодействующих с определенными типами рецепторов. Эти токсины предполагается использовать для выявления участия определенных рецепторов в развитии заболеваний и распределении рецепторов в тканях. Конъюгаты различных токсинов с флоуресцентными наночастицами позволяют исследовать распределение рецепторов в тканях. В частности в первую очередь рассматриваются конъюгаты флуоресцентных наночастиц с такими токсинами как альфа-нейротоксины и фактор роста нервов из ядов змей. Наличие таких конъюгатов позволит детектировать распределение рецепторов в тканях в норме и при патологии. Реализация проекта направлена на решение проблемы визуализации некоторых типов опухолей, в которых уровень экспрессии никотиновых холинорецепторов и рецепторов Trk A, обладающих высоким сродством к фактору роста нервов, существенно превышает уровень экспрессии в норме, а также проблемы детекции изменения уровня экспрессии этих рецепторов при нейродегенеративных заболеваниях. Целью проекта является разработка конъюгатов полупроводниковых флоуресцентных функционализированных нанокристаллов с альфа-нейротоксинами и фактором роста нервов из ядов змей для дальнейшего применения их в медицине, научных исследованиях и для создания тест систем, а также выявление с их помощью особенностей строения и распределения рецепторов в тканях в норме и при патологии. Так, флуоресцентные конъюгаты альфа-нейротоксинов, обладающие высоким сродством и избирательностью взаимодействия с определенными подтипами никотиновых холинорецепторов, могут быть использованы для детектирования распределение этих рецепторов в тканях в норме и при патологиях, включая нейродегенеративные и онкологические заболевания. Фактор роста нервов является высокоаффинным и селективным лигандом Trk A рецептора, относящегося к семейству рецепторных тирозин киназ. Изменения уровня экспрессии этого рецептора обнаружены в ряде опухолей. Для исследования гиперэкспрессии рецепторов Trk A в опухолевых клетках будут использованы конъюгаты флуоресцентных наночастиц с фактором роста нервов. Полученные в результате проекта знания и продукты в виде конъюгатов токсинов с флуоресцентными наночастицами в дальнейшем могут использоваться как в медицине для создания диагностикумов и для прокрашивания операционного поля в операциях по удалению опухолей, так и в лабораторных исследования. Конъюгаты токсинов с другими типами наночастиц в перспективе могут быть использованы для создания новых лекарственных препаратов.

Основные планируемые результаты проекта:
В результате выполнения проекта планируется получить следующие результаты:
1.Разработанные методики
а) Методики выделения и очистки альфа-нейротоксинов змей и фактора роста нервов;
б) Методики получения и экспериментальные образцы конъюгатов флуоресцентных наночастиц с альфа-нейротоксинами и фактором роста нервов;
в) Методика получения и функционализации флуоресцентных наночастиц с различными оптическими характеристиками;
г) Методика визуализации никотиновых и Trk А рецепторов в тканях с использованием конъюгатов флуоресцентных наночастиц с альфа-нейротоксинами и фактором роста нервов;
2.Лабораторные образцы альфа–нейротоксинов и фактора роста нервов из ядов различных видов змей;
3. Проект ТЗ на выполнение ПНИЭР по теме: «Разработка новых диагностических и терапевтических средств на основе токсинов змеиных ядов, меченных функционализированными наночастицами».
4. Публикации по результатам исследований и разработок в научных журналах, индексируемых в базе данных Scopus или в базе данных "Сеть науки" (Web of Science);
5. Заявки на получение охранных документов.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
В результате выполнения проекта будут разработаны методики синтеза и получены конъюгаты флуоресцентных наночастиц с токсинами. Разрабатываемые методы конъюгации обеспечат ковалентное связывание альфа-нейротоксинов и фактора роста нервов с наночастицами и приведут к получению конъюгатов, устойчивых в условиях проведения экспериментов с рецепторами и клетками. Полученные конъюгаты будут стабильными в течение времени проведения наблюдения под флуоресцентным микроскопом не менее 1 часа и должны быть устойчивы в диапазоне рН от 7 до 8 и при температуре от 4 до 37º С. Разрабатываемые конъюгаты альфа-нейротоксинов змей и факторов роста нервов будут сохранять высокий уровень исходной биологической активности нативных белков и обеспечивать высоко специфическое связывание с холинорецепторами и Trk А рецепторами. Разработанные конъюгаты токсинов змеиных ядов с флуоресцентными нанокристаллами будут обеспечивать визуализацию связывания рецепторов с конъюгатами для идентификации распределения и анализа структуры рецепторов в клетках и тканях ex vivo, в том числе окрашивание клеток и тканей будет видимым с использованием флуоресцентного микроскопа. Разработанная методика исследования распределения и структуры холинорецепторов и Trk А рецепторов позволит определять различия в количестве экспрессирующихся рецепторов в нормальных или патологических клетках и тканях для случая нейродегенеративных и онкологических заболеваний.
Все экспериментальные исследования будут выполняться с использованием самых современных инструментов и методов. Так для выделения токсинов их конъюгатов с флуоресцентными нанокристаллами будут использованы современные методы высокоэффективной хроматографии, а для характеристики токсинов методы белковой химии и масс-спектрометрии. Для анализа взаимодействия конъюгатов с биологическими мишенями также планируется использование современных методов флуоресцентной микроскопии.
Запланированные работы соответствуют исследованиям, проводимым в ведущих зарубежных лабораториях. Предполагается, что в результате выполнения проекта впервые удастся визуализировать никотиновые холинорецепторы и рецепторы Trk A на трансформированных клетках.
Для достижения заявленных результатов разработан и утвержден план экспериментальных работ. В настоящий момент препятствий для успешного выполнения проекта не выявлено.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Прогнозируемый способ использования разрабатываемой технологии заключается в возможности использования новых технологических решений для получения знаний о молекулярных механизмах развития ряда социально значимых заболеваний и, как следствие, поиска эффективных путей борьбы с ними.
В результате реализации проекта могут быть разработаны новые соединения для визуализации рецепторов в клетках, тканях и органах, что позволит получить новые знания о молекулярных механизмах развития ряда социально значимых заболеваний. Благодаря сотрудничеству с индийским партнером будет происходить обмен знаниями и навыками, будет получен доступ к новым методикам и оборудованию, что будет способствовать укреплению связей между Индией и Россией. Кроме того, выполнение проекта будет способствовать дальнейшему развитию исследования медицинского и диагностического применения змеиного яда и токсинов и повысит возможности привлечения дополнительного финансирования.
Разработанные конъюгаты полупроводниковых функционализированных флуоресцентных наночастиц позволят упростить и ускорить процесс визуализации рецепторных молекул и маркеров заболеваний. Также они смогут использоваться в качестве флуоресцентных доноров в системах детекции с передачей энергии, в частности в технологиях, основанных на процессах резонансного переноса энергии (RET, FRET). Это позволит заменить существующие широко используемые в биологии и медицине флуоресцентные метки на основе органических красителей в виду ограниченности их спектральных характеристик.
С практической точки зрения, разрабатываемые конъюгаты могут быть востребованы научными лабораториями для исследования структуры и распределения рецепторов в клетках, тканях и органах. Другой важной областью применения конъюгатов флуоресцентных наночастиц с токсинами может быть их использование для прокрашивания тканей во время проведения операций, в том числе при удалении опухолевых образований для более точного определения границ опухоли. Также конъюгаты токсинов с флуоресцентными наночастицами могут быть использованы для создания диагностикумов с целью выявления в сыворотке крови антител на эндогенные белки, родственные соответствующим токсинам.
Методы нанотехнологии, применяемые в данном проекте, позволяют надеяться на появление в самом ближайшем будущем диагностикумов нового поколения, основанных на полупроводниковых флуоресцентных нанокристаллах и обеспечивающих рекордную чувствительность и быстроту параллельного анализа многих биологических параметров. Последние достижения в синтезе, биоадаптировании и биоконъюгации нанокристаллов позволяют констатировать появление принципиально нового класса оптических меток, обладающих свойствами, способными принципиально изменить видение диагностики будущего. Использование нанокристаллов может стать основой новых неразрушающих методов визуализации рецепторных молекул и маркеров заболеваний, позволяя не только проводить их сверхчувствительную детекцию, но и отслеживать их эволюцию и взаимодействие в реальном времени.

Текущие результаты проекта:
К настоящему моменту полностью выполнены все теоретические этапы проекта, в том числе:
Выполнен аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы, посвященный методам выделения токсинов из ядов змей, методикам синтеза флуоресцентных наночастиц, методам конъюгации наночастиц с белками, а также исследованию взаимодействия токсинов с рецепторами;
Выполнены патентные исследования в соответствии с ГОСТ 15.011-96;
Проведено исследование и сравнительной оценка вариантов возможных решений задачи;
Проведено обоснование выбора оптимального варианта решения задачи;
Проведен информационный анализ современных методов разделения ядов змей, а также проведена разработка и анализ возможных подходов к выделению токсинов из ядов змей с учетом применимости в лабораторных условиях исполнителей проекта;
Проведено обоснование необходимости проведения экспериментальных исследований и вида экспериментальной реализации;
Осуществлен выбор методов синтеза флуоресцентных нанокристаллов и их поверхностной модификации;
Разработан метод конъюгации наночастиц с функцианализированной поверхностью с токсинами;
Разработан план исследований с учётом ГОСТ 53434-2009, включающий программы и методики экспериментальных исследований;

Проведены следующие экспериментальные работы:
Проведена апробация разработанных методов очистки альфа-нейротоксинов и факторов роста нервов из ядов змей;
Проведен выбор оптимальной схемы выделения токсинов из ядов змей (кобры и крайта);
Осуществлен синтез флуоресцентных наночастиц с различными оптическими характеристиками;
Проведена поверхностная модификация флуоресцентных наночастиц с использованием различных реагентов;
Осуществлена конъюгация флуоресцентных наночастиц с токсинами, разработаны методы очистки конъюгатов и получены конъюгаты различных токсинов с наночастицами;
Проведены предварительные исследования взаимодействия конъюгатов с рецепторами и установлено окрашивание клеток, экспрессирующих холинорецепторы, конъюгатами альфа-нейротоксинов.