Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка подхода серийной кристаллографии мембранных светочувствительных белков при комнатной температуре на базе Европейского центра синхротронных исследований

Номер контракта: 14.587.21.0014

Руководитель: Борщевский Валентин Иванович

Должность: старший научный сотрудник

Организация: федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Московский физико-технический институт (государственный университет)"
Организация докладчика: федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский физико-технический институт (государственный университет)"

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
серийная кристаллография, мембранные белки, переходные состояния, фотоактивные белки, сбор дифракционных данных

Цель проекта:
Рентгеновская кристаллография является наиболее важным методом для определения структуры белка. Почти 90% из более чем 95 000 структур в PDB-банке (http://www.rcsb.org) были решены с использованием этого метода. Не смотря на это, стандартный подход к рентгеновской кристаллографии имеет ограничения. Одно из наиболее важных ограничений – необходимость выращивания достаточно больших и хорошо дифрагирующих белковых кристаллов. Качество дифракции таких кристаллов должно позволять собирать достаточное количество дифракционных данных за время экспозиции кристалла, которое ограничено в силу его радиационного повреждения. Для сбора дифракционных данных с небольших кристаллов в настоящее время используют специальные экспериментальные подходы. Однако, данные подходы плохо применимы для использования на синхротронных источниках излучения. В предлагаемом проекте мы ставим задачу разработать оптимизированный подход сбора дифракционных данных с микрокристаллов (серийная кристаллография) мембранных фотоактивных белков при комнатной температуре на синхротронных источниках излучения. Проведение ключевых экспериментов будет выполнено на установке id23-1 Европейского центра синхротронных исследований. Ключевым фактором выбора условий проведения дифракционных измерений при комнатной температуре является отсутствие артефактов, возникающих в условиях нефизиологических температур (Fraser et al., 2011). Так, необходимость замораживания образцов приводит к невозможности проведения время-разрешенных экспериментов, необходимых для решения переходных состояний белков и установления структурных деталей механизма их работы. В проект будет создан научно-технический задел в разработке подходов к получению структур переходных состояний белков на синхротронах последнего поколения и РЛСЭ. В качестве объекта исследования выбраны микрокристаллы фотоактивных мембранных белков bR и KR2. Данный выбор не случаен. Во-первых, данный класс белков позволяет получать хорошо дифрагирующие кристаллы методом кристаллизации в кубической фазе (см. например, Gushchin et al., 2015; Gushchin et al. 2013...). Во-вторых, рабочий цикл данных белков может быть активирован при помощи облучения лазерной вспышкой, что позволяет создать задел для дальнейшего развития методологии время-разрешенной серийной кристаллографии, в которой время запуска фотоцикла белка будет синхронизировано с вспышкой рентгеновского измерительного пучка для получения структур переходных состояний. В-третьих, исследуемый объект представляет важность сам по себе, поскольку является одним из потенциальных "инструментов" для оптогенетического контроля клеток (Deisseroth, K. (2011)) – новейшего междисциплинарного направления в биотехнологии, объединяющего молекулярную и клеточную биологию, электрофизиологию, оптику, электронику и генную инженерию. Оптогенетика – новейшее междисциплинарное направление в биотехнологии, объединяющее молекулярную и клеточную биологию, электрофизиологию, оптику, электронику и генную инженерию. В 2010 году оптогенетика была выбрана Методом Года среди всех областей науки и инженерии по версии междисциплинарного научного журнала Nature Methods. В том же году оптогенетика была охарактеризована в статье как «прорыв десятилетия» в научно-исследовательсоком журнале Science. Оптогенетика важна для фундаментальной академической науки и одновременно является многообещающим методом вмешательства в мозговую деятельность и исправления определенных патологических процессов, задействованных в частности в таких тяжелых заболеваниях и расстройствах, как болезнь Паркинсона, эпилепсия, наркотическая зависимость, депрессия, нарушение сна, боль и шизофрения активно и углубленно разрабатываются в настоящее время. Между тем суть метода проста: для фотоконтроля клетки используют светоактивные мембранные белки, которые исследуются в данном проекте. Получение структур данных белков при комнатной температуре (что является одним из запланированных результатов работы), послужит углублению знаний о принципах работы данных белков и возможно разработке более тонких инструментов для фотоконтроля клетки. В-четвертых, используемый в работе класс белков является модельным для семейства 7-спиральных трансмембранных белков, который включает ряд чрезвычайно важных объектов для исследований. Речь идет не только об инструментах для оптогенетического контроля клеток и органелл, описанных ранее, но и о самом обширном классе рецепторов человека - GPCR. Получаемые в работе результаты смогут быть прямо транслированы на широкий класс перспективных объектов структурной биологии. Необходимо отметить, что серийная кристаллография (в том числе и при комнатной температуре) является одним из приоритетных направлений развития Европейского центра синхротронного излучения (ESRF UPGRADE PROGRAMME PHASE II (2015-2022), The orange book, стр.26 - 31), что подчеркивает актуальность и важность решаемых в проекте задач, а также перспективность предлагаемых подходов.

Основные планируемые результаты проекта:
Планируется, что основным результатом работы будет разработка экспериментальных подходов к серийной кристаллографии мембранных светочувствительных белков. Достижение этого результата предполагает решение ряда промежуточных задач:
1) Разработка генетических конструкций белковых препаратов целевых белков (KR2 из Krokinobacter eikastus и bR из Halobacterium salinarum) для проведения экспрессии в e.coli.
2) Проведение экспрессия целевых белков в e.coli.
3) Функциональная характеризация белковых препаратов целевых белков (KR2 из Krokinobacter eikastus и bR из Halobacterium salinarum).
4) Проведение кристаллизации целевых белков.
5) Проведение тестовых экспериментов по апробации кубической фазы моноолеина в качестве носителя для удержания белковых кристаллов на id23-1 Европейского центра синхротронного излучения
6) Проведение экспериментов по использованию минерального масла или полимерных пленок для поддержания влажности образца на id23-1 Европейского центра синхротронного излучения
7) Проведение экспериментов по поддержанию влажности образца при помощи соответствующего прибора непосредственно на id23-1 Европейского центра синхротронного излучения
8) Апробация подходов к сбору дифракционных данных с кристаллов целевых белков на id23-1 Европейского центра синхротронного излучения.
Предполагается, что в конечном итоге экспериментальные подходы позволят получить рентгеновские структур целевых белков (KR2 из Krokinobacter eikastus и bR из Halobacterium salinarum) при комнатной температуре.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
Современные тенденции в области совершенствования источников синхротронного излучения, рентгеновской оптики и детекторов рентгеновского излучения способствуют переходу от ставшего традиционным метода сбора дифракционных данных от белковых кристаллов при криогенной температуре 100К к методу проведения экспериментов при комнатной температуре.
Основной причиной такого перехода является существенное отличие организации функционально важных областей белка в структурах, полученных при 100К, и в условиях комнатной температуры. Указанная особенность является свидетельством артефактов, которые возникают при отходе от физиологически релевантных условий сбора данных. Кроме того, измерения, выполненные при комнатной температуры, делают возможным проведение время-разрешенных исследовании и исключают необходимость подбора криопротекторов. В процессе проведения эксперимента облучаемый образец подвергается радиационным повреждениям, что ограничивает разрешение дифракционных данных, получаемых с одного кристалла. При комнатной температуре этот эффект наиболее заметен. Для его устранения дифракционные данные собираются последовательно с нескольких кристаллов, что позволяет распределить общую поглощенную рентгеновскую дозу по всему ансамблю.
В последнее время были разработаны несколько экспериментальных подходов, для успешного сбора данных с набора кристаллов. Данные подходы были разработаны для конкретных экспериментальных задач, где и нашли свое применение.
Не смотря на достигнутые на сегодняшний день результаты, количество и качество применяемых подходов к получению белковых структур при комнатной температуре методами серийной кристаллографии на синхротронных источниках рентгеновского излучения находится на достаточно низком уровне. Разработке и развитию данных подходов посвящен настоящий проект.
Начальные стадии проекта предполагают создание объектов для исследования – кристаллов мембранных фотоактивных белков. Конкретными мишенями в проекте выбраны KR2 из Krokinobacter eikastus и bR из Halobacterium salinarum.
Первая задача проекта - подготовка генетических конструкций белковых препаратов целевых белков. На этом этапе будет проведена подготовка генов белка для последующей экспрессии. Вторая задача проекта - экспрессия целевых белков и их очистка. Экспрессия будет проводиться в клетках e.coli. В настоящее время при участии МФТИ разработаны методы, позволяющие проводить экспрессию упомянутых белков-мишеней в клетках e.coli в достаточно больших количествах (Gushchin, I., Shevchenko, V., Polovinkin, V., Kovalev, K., Alekseev, A., Round, E., … Gordeliy, V. (2015). Crystal structure of a light-driven sodium pump. Nature Structural & Molecular Biology, (April). doi:10.1038/nsmb.3002; Bratanov, D., Balandin, T., Round, E., Shevchenko, V., Gushchin, I., Polovinkin, V., … Gordeliy, V. (2015). An Approach to Heterologous Expression of Membrane Proteins. The Case of Bacteriorhodopsin. Plos One, 10(6), e0128390. doi:10.1371/journal.pone.0128390). Экспрессия белков в e.coli является традиционным и хорошо разработанным подходом, поэтому правильность этого выбора не вызывает сомнений. В ходе выполнения проекта предполагается оптимизация и доработка методов. Третьей задачей проекта являются проверка функциональности белков - проверка качества полученных белковых препаратов. Хорошо зарекомендовавшим себя подходом для данной задачи является спектроскопический подход, который и планируется применить в данной работе. Четвертая задача проекта - получение кристаллов целевых белков. Используемые в данной работе белки поддаются кристаллизации в липидной кубической фазе. Команда исполнителей МФТИ хорошо знакома с данным методом и именно его планируется применять в данном проекте. Дальнейшие задачи проекта связаны непосредственно с проведением экспериментов в Европейском центре синхротронных излучения. Основным направлением деятельности является развитие стандартного подхода сбора данных при криогенной температуре 100К в криопетлях для комнатной температуры. Развитие будет сосредоточено на следующем:
(1) разработка системы-носителя кристаллов, необходимой для обеспечения контроля положения кристаллов в криопетле. Носитель, должен обладать достаточной вязкостью, препятствующей смещению кристалла во время манипуляции;
(2) доработка криопетли для обеспечения постоянной влажности образца; Возможные подходы могут заключаться в использование минерального масла, окутывающего образец, или полимерных пленок;
(3) апробация прибора для поддержки влажности образца, стандартно используемого на измерительном пучке id23-1 Европейского центра синхротронного излучения;
(4) апробация различных подходов к сбору дифракционных данных. Среди таких подходов можно выделить (а) сканирование пробы рентгеновским пучком для поиска дифрагирующих кристаллов с последующим сбором частичных наборов данных с выбранных кристаллов; (б) сквозное спиральное сканирование содержимого криопетли с непрерывным сбором данных.
Предполагается, что в конечном итоге экспериментальные подходы позволят получить рентгеновские структур целевых белков (KR2 из Krokinobacter eikastus и bR из Halobacterium salinarum) при комнатной температуре.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Областью применимости данного исследования является структурная биология. Разрабатываемые подходу служат получению структур белков при комнатной температуре, с фокусом на мембранные белки - класс белков, который в настоящее время представляет особый интерес для структурных исследований. Кроме этого разрабатываемые подходы создают задет для время-разрешенной серийной кристаллографии - методики, которая в будущем позволит узнавать структуры переходных состояний белков и восстанавливать их функцию.
В силу особого выбора белков-мишеней (фотоактивные мембранные белки KR2 и bR) проект представляет интерес для оптогенетики - метода контроля функционирования клеток и органелл при помощи света. Получаемая в проекте структурная информация позволит глубже понять принципы работы данных белков и возможно послужит созданию более тонких инструментов для фотоконтроля клетки. Развитие метода серийной кристаллография белков при комнатной температуре является чрезвычайно важной задачей для синхротронных источников рентгеновского излучения. В частности, в программе обновления Европейского центра синхротронных исследований на 2015-2020 года (ESRF UPGRADE PROGRAMME PHASE II (2015-2020), The Orange Book, стр. 28 -30) серийная кристаллография и связанные с ней подходы объявляются методиками, которые будут доступны для пользователей после обновления мегаустановки. Помимо синхротронных источников излучения разрабатываемые подходы могут быть использованы на белковых станциях рентгеновских лазеров на свободных электронах, включая будущий eXFEL в Гамбурге, Германия.

Текущие результаты проекта:
На данный момент проведена подготовка образцов для серийной кристаллография мембранных светочувствительных белков:
1) Разработаны генетические конструкций белковых препаратов целевых белков (KR2 из Krokinobacter eikastus и bR из Halobacterium salinarum) для проведения экспрессии в e.coli.
2) Проведена экспрессия целевых белков в e.coli.
3) Проведена функциональная характеризация белковых препаратов целевых белков (KR2 из Krokinobacter eikastus и bR из Halobacterium salinarum).
4) Проведена кристаллизации целевых белков.