Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка методов мультипараметрического исследования структуры клеточных макро- и микроносителей с помощью сканирующей зондовой нанотомографии

Номер контракта: 14.604.21.0001

Руководитель: Агапов Игорь Иванович

Должность: заведующий лабораторией

Организация: федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации
Организация докладчика: федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
сканирующая зондовая микроскопия; нанотомография; биоинженерия, клеточные микроносители, биосовместимые матриксы.

Цель проекта:
Основной задачей, на решение которой направлен проект, является разработка новых методов ис-следование микро- и наноструктуры биологических объектов, тканей и материалов. Цель проекта - создание научно-технологического задела в области разработки новой технологии мультипараметрического наномасштабного анализа трехмерной структуры клеточных макро- и микроносителей. Предлагаемая концепция достижения цели проекта заключается в объединении методик сканирующей зондовой микроскопии (СЗМ) и ультрамикротомии при низких температурах (криоУМТ) в рамках одной измерительной системы для сканирующей зондовой нанотомографии (СЗНТ).

Основные планируемые результаты проекта:
1. Промежуточные и заключительный отчет о ПНИ, содержащие, в том числе:
обзор и анализ современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей научно-техническую проблему, исследуемую в рамках ПНИ;
результаты экспериментальных исследований и апробации вновь разработанных технических принципов и методических подходов в форме отчета о выполнении исследований структуры клеточных макро- и микроносителей с помощью СЗНТ.
технико-экономическую оценку результатов ПНИ;
обобщение и выводы по результатам ПНИ;
рекомендации и предложения по использованию результатов ПНИ.
2. Макет экспериментального комплекса для реализации сканирующей зондовой нанотомографии и пакет технической документации на него.
3. Программа и методики исследований клеточных макро- и микроносителей с использованием сканирующей зондовой нанотомографии.
4. Технологические инструкции получения:
пористых макроносителей на основе регенерированного шелка с добавлением и без добавления микрочастиц гидроксиапатита.
альгинатных гидрогелевых микроносителей;
макроносителей на основе регенерированного шелка и альгинатных гидрогелевых микроносителей, поверхности которых модифицированы микрочастицами децеллюляризированного внеклеточного матрикса
макро- и микроносителей, витализированных эукариотическими клетками.
5. Проект ТЗ на проведение ОКР по теме «Разработка опытного образца аппаратно-программного комплекса для мультипараметрического исследования структуры клеточных макро- и микроносителей с помощью сканирующей зондовой нанотомографии».

Основные характеристики результатов и научно-технической продукции:
Разрабатываемые в ходе проекта методики должны обеспечить:
1. возможность изучения микро- и наноструктуры мягких (с температурой стеклования < 0°C) и гидрогелевых биополимерных клеточных макро- и микроносителей методом сканирующей зондовой нанотомографии при низких температурах.
2. возможность эффективного изучения микро- и наноструктуры биоискусственных клеточных конструкций методом сканирующей зондовой нанотомографии без химической фиксации клеток.
3. возможность многопараметрического исследования микро- и нанораспределений локальных физических свойств, таких как локальная упругость и вязкость в объеме биоматериалов.
4. возможность исследования трехмерной наноструктуры нано- и микропористых биосовместимых матриксов и биоискусственных клеточных конструкций на их основе.

- Матриксы из фиброина шелка были получены методом выщелачивания с использованием в качестве порообразователя частиц хлорида натрия с размером от 50 до 600 мкм.
- Выполненные исследования макроматриксов из фиброина шелка позволяют изучать степень микро- и нанопористости, характерные размеры пор в матриксах и степень взаимосвязанности пор в матриксе, распределениеи структуру минеральных и биологических микрочастиц в макроносителях.
- Альгинатные гидрогелевые микроносители получены методом осаждения в растворе хлорида кальция. Форма микроносителей: близкая к сферической; размеры микроносителей: диаметр от 200 до 300 мкм. Количество экспериментальных образцов микроносителей: не менее 10000 в суспензии 0,1 мл. для каждого вида образцов.
- Размер микрочастиц децеллюляризированного внеклеточного матрикса печени крысы линии Вистар, предназначенных для модификации поверхности макроматриксов и микроносителей: не более 1-5 мкм; микрочастицы матрикса печени крысы получены при помощи измельчения при низких температурах (минус 196°С) с использованием жидкого азота.
- Разработанные методы пробоподготовки позволяют изучать наноструктуру гидрогелевых микроносителей применением методов криоультрамикротомии и сканирующей зондовой микроскопии при низких температурах.
Основные функциональные параметры изготовленного макета экспериментального комплекса для реализации сканирующей зондовой нанотомографии клеточных макро- и микроносителей:
1) толщина среза образца – от 25 до 500 нм;
2) максимальный размер поверхности срезаемого образца – не менее 3×3 мм;
3) рабочий диапазон температур от минус 190°С до 25°С.
4) максимальный размер области сканирования СЗМ – 50х50х5,0 мкм (при температуре 25°С);
5) уровень шума по оси Z 0.05 нм RMS;
6) латеральное разрешение в плоскости образца XY не более 10 нм;
7) реализуемые методики СЗМ: топография, фазовое изображение поверхности;
8) рабочий диапазон температур от минус 190°С до 25°С;
Полученные результаты полностью соответствуют требования ТЗ и ПГ проекта. Полученные результаты разработки модифицированных альгинатных микроносителей и сборочных единиц макета экспериментального комплекса являются уникальными по сравнению с мировым уровнем.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
Основными конечными продуктами, создаваемыми с использованием результатов проекта, являются макет экспериментального комплекса для реализации сканирующей зондовой нанотомографии и пакет технической документации на него, программа и методики исследований клеточных макро- и микроносителей с использованием сканирующей зондовой нанотомографии и результаты выполненных исследований
- анализа микро- и наноструктуры биосовместимых клеточных макро- и микроносителей. Подобное исследование для данного класса биологических материалов и объектов будет выполнено впервые.

Реализация данных методик и подходов с помощью разрабатываемого прототипа экспериментального приборного комплекса позволит получать уникальную наномасштабную информацию о трехмерной структуре клеточных макро- и микроносителей, а так же других биополимерных и гидрогелевых материалов и биологических объектов, недоступную другими методами микроскопических исследований.

Разрабатываемые методы позволят существенно расширить существующие представления о наноструктурных особенностях биологических объектов и тканей, нанокомпозитных биологических и биополимерных материалов, перспективных для применений в регенеративной медицине.

Разрабатываемые методические и аппаратные подходы для реализации криоСЗНТ должны соответствовать следующим базовым характеристикам:

1. Возможность измерений основными методами СЗМ (топография, фазовые и амплитудные методики) поверхности образцов непосредственно после среза криоультрамикротомом in situ в рамках рабочего цикла срезания УМТ в диапазоне температур от минус 140°С до 25°С.
2. Согласованное функционирование СЗМ и криоультрамикротома для возможности 3D реконструкции структуры образцов на основе последовательных измерений с возможностью комплементарного анализа срезов методами электронной микроскопии.
3. Обеспечение достаточного разрешения СЗМ, необходимого для изучения ультраструктуры биоматериалов изучаемых клеточных носителей и биоинженерных конструкций на их основе – уровень шума по вертикали Z 0.05 нм RMS, латеральное разрешение в плоскости образца XY 5-10 нм.

Для достижения заявленных результатов необходимо отработать методы получения пористых и гелевых макро- и микроносителей образцов для экспериментальных исследований:
методы получения пористых макроносителей на основе регенерированного шелка с добавлением и без микрочастиц гидроксиапатита;
методы получения альгинатных гидрогелевых микроносителей со средним размером 240 мкм;
методы получения микрочастиц децеллюляризированного с помощью сильных детергентов матрикса печени крысы с размером не более 1-5 мкм при помощи измельчения при низких температурах (минус 190°С) с использованием жидкого азота
методы модификации поверхности пористых макроносителей на основе регенерированного шелка и альгинатных гидрогелевых микроносителей микрочастицами децеллюляризированного внеклеточного матрикса путем ковалентной иммобилизации;
методы витализации полученных макро- и микроносители эукариотическми клетками линии HEPG2.

Для исследования трехмерной микро и наноструктуры полученных носителей и анализа взаимодействия клеток с компонентами биоинженерных конструкций на основе данных биоматериалов используется уникальный метод сканирующей зондовой нанотомографии. Этот метод основан на объединении техник сканирующей зондовой микроскопии (СЗМ) и ультрамикротомии. С помощью разработанного экспериментального комплекса СЗМ/криоультрамикротом предполагается получение изображения морфологии и карт распределения локальных физических характеристик (упругость, вязкость) наноразмерных структур в плоскости поверхности изучаемого объекта после каждого выполненного сверхтонкого среза. Таким образом, в результате будет получен массив двумерных карт (срезов) морфологии и распределений физических свойств с шагом по глубине до 25 нм. При помощи специализированного программного обеспечения серии получаемых изображений будут преобразовываться в визуализированные трехмерные представления морфологии наноразмерных структур и трехмерные распределения физических свойств в объеме нанокомпозитных биоматериалов с разрешением в десятки нм. Необходимо отметить, что подобный метод пока не применялся для анализа подобных гелевых биоматериалов и биоискусственных структур ни в России, ни за рубежом, и его применение для подобных объектов требует решения ряда методических и аппаратных задач, связанных как с подготовкой образцов, так и непосредственно с измерениями.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Результаты, полученные в рамках выполнения данного проекта, могут быть использованы в таких областях, как: биоинженерия, структурная биология, регенеративная медицина, биотехнология, нанотехнология, материаловедение, микроскопия высокого разрешения для решения широкого класса задач, как в научной, так и в производственной сфере. Основной областью применения подобного оборудования является метрологическое обеспечение нанотехнологических и материаловедческих исследований и разработок в области биоинженерии, создания и контроля качества новых фармацевтических препаратов и изделий медицинского назначения и анализа структур биотканей для целей медицинской диагностики. Данное направление развития современной технологии является бесспорным государственным приоритетом не только для России, но для подавляющего большинства технологически развитых стран мира.
Основной задачей сканирующей зондовой нанотомографии, которую планируется развивать в рамках данного проекта, является получение уникальной информации о нативной трехмерной наноструктуре и распределении физических свойств с высоким разрешением в объеме нанокомпозитных биоматериалов и биоискусственных структур на их основе. Такими возможностями для многих классов биообъектов и биоматериалов не обладает ни одна из известных на данный момент измерительных методик. В качестве основных потребителей научно-технического результата, предполагаемого в данной работе, могут выступать научно-исследовательские учреждения, внедренческие лаборатории, инновационные и промышленные предприятия работающие в области приоритетных направлений бионаноиндустрии (нано- и микробиология, фармацевтика, тканевая инженерия, регенеративная медицина и др.) и других перспективных направлений (полимеры, нанокомпозитные материалы, биоматериалы) как в России, так и за рубежом.

Текущие результаты проекта:
- Изготовлены экспериментальные образцы синтезированных из фиброина шелка пористых макроматриксов с добавлением и без добавления гидроксиапатита.
- Разработана методика модификации синтезированных из фиброина шелка пористых макроматриксов микрочастицами децеллюляризированного внеклеточного матрикса печени крысы.
- Разработана технологическая инструкция получения пористых макроносителей на основе регенерированного шелка с добавлением и без добавления микрочастиц гидроксиапатита.
- Разработана технологическая инструкция получения макроносителей из фиброина шелка, модифицированных микрочастицами децеллюляризированного матрикса.
- Разработана методика пробоподготовки и предварительной характеризации синтезированных из фиброина шелка пористых макроматриксов для исследований методом СЗНТ.
- Выполнены экспериментальные исследования синтезированных из фиброина шелка макроносителей с применением методов ультрамикротомии и сканирующей зондовой микроскопии и нанотомографии.
- Выполнены патентные исследования. Установлены патентоспособные технические решения в рамках разработок проекта, рекомендованные для патентования.
- Разработан комплект технической документация на макет экспериментального комплекса для сканирующей зондовой нанотомографии,
- Изготовлены экспериментальные образцы альгинатных гидрогелевых микроносителей.
- Разработана методика пробоподготовки и предварительной характеризации альгинатных микроносителей.
- Разработана технологическая инструкция получения альгинатных гидрогелевых микроносителей.
- Разработана методика модификации альгинатных гидрогелевых микроносителей микрочастицами децеллюляризированного матрикса.
- Разработана технологическая инструкция получения альгинатных микроносителей, модифицированных микрочастицами децеллюляризированного матрикса.
- Изготовлены сборочные единицы экспериментального комплекса (блок микропроцессорного управления, система сканирования образцов, измерительный модуль сканирующего зондового микроскопа).
- Разработано программное обеспечение на макет экспериментального комплекса.
- Выполнено изготовление, монтаж и отладка макета экспериментального комплекса.
- Разработаны Программы и методики испытаний макета экспериментального комплекса.
- Разработаны Программы и методики экспериментальных исследований клеточных макро- и микроносителей.
- Разработаны методики витализации макро- и микроносителей клетками линии HepG2 и пробоподготовки и предварительной характеризации макро- и микроносителей витализированных клетками линии HepG2. .
- Разработана технологическая инструкция получения макро- и микроносителей, витализированных эукариотическими клетками.
Полученные результаты полностью соответствуют требования ТЗ и ПГ проекта. Полученные результаты разработки модифицированных альгинатных микроносителей и технические решения макета экспериментального комплекса являются уникальными по сравнению с мировым уровнем.
Ряд полученных результатов опубликован в следующих научных публикациях:
1. A.E. Efimov, M.M. Moisenovich, V.G. Bogush and I.I. Agapov, 3D nanostructural analysis of silk fibroin and recombinant spidroin 1 scaffolds by scanning probe nanotomography, RSC Advances, 2014, 4, 60943-60947. (индексируется WoS и Scopus, импакт-фактор ISI 3.7);
2. А.Е. Ефимов, М.М. Мойсенович, А.Г. Кузнецов, Л.А. Сафонова, М.М. Боброва, И.И. Агапов, Исследование микро- и наноструктуры биосовместимых матриксов из регенерированного фиброина Bombyx mori методом сканирующей зондовой нанотомографии, Российские нанотехнологии, 2014, том 9 №11-12, с. 68-72.(индексируется Scopus, импакт-фактор РИНЦ 0,89;
3. A. E. Efimov, O. I. Agapova, I. I. Agapov Scanning Probe Nanotomograph: Features of Engineering Solutions for Low-Temperature Analysis of Biomedical Materials, Biomedical Engineering, 2015, 49(3), 132-135. (индексируется Scopus);
4. A.E. Efimov, O.I. Agapova, K.E. Mochalov, I.I. Agapov, Three-dimensional Analysis of Nanomaterials by Scanning Probe Nanotomography, Physics Procedia, 73, 2015, 173–176. (индексируется Scopus);
5. М.М. Боброва, Л.А. Сафонова, О.И. Агапова, М.Е. Крашенинников, М.Ю. Шагидулин, И.И. Агапов, Децеллюляризация ткани печени как перспективная технология получения пористого матрикса для тканевой инженерии и регенеративной медицины, Современные технологии в медицине, том 7, №4, в печати (индексируется Scopus).

Подана патентная заявка РФ на изобретение «Способ измерения поверхности объекта в режиме сканирующего зондового микроскопа» (RU2015124125, дата приоритета 22.06.2015).
Подана патентная заявка РФ на изобретение "Координатный стол" (RU2015150092, дата приоритета 23.11.2015).
По результатам проекта 27.10.2015 защищена диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук "Сканирующая зондовая нанотомография для исследования 3D структуры матриксов для тканевой инженерии и регенеративной медицины", соискатель - исполнитель Агапова О.И.
Привлечено 1.81 млн. руб. внебюджетных средств на выполнение проекта. Результаты проекта были представлены на трех научных конференциях: Физтехбио-2015, Научная сессия МИФИ-2015, Nanotech-2015 (США).