Регистрация / Вход
Прислать материал

Новые средства для лечения травматических и ишемических повреждений тканей на основе биодеградируемых материалов с иммобилизованными пептидами-агонистами рецепторов, активируемых протеиназами

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
ишемия; нейродегенерация; воспаление; репарация тканей; цитопротекция; рецепторы, активируемые протеиназами; активированный протеин с; тучные клетки; астроциты; кератиноциты; иммобилизация; полимерный носитель; фиброин шелка

Цель проекта:
1. Основной задачей проекта является создание синтетических аналогов эндогенных пептидов-регуляторов воспаления и репарации тканей с цитопротекторными свойствами. Синтезированные препараты должны обладать высокой эффективностью и направленностью действия для купирования острых и хронических воспалительных ответов и эффективного восстановления функций клеток и тканей. Основой таких препаратов могут служить агонисты ПАР1 (ПА-АПС) - индукторы процессов регуляции функций клеток после травматического или ишемического повреждения различных тканей. 2. Создание новых эффективных средств для лечения травматических и ишемических повреждений тканей на основе пептида – агониста рецепторов ПАР1, иммобилизованного в полимерные носители, и разработка оптимальных условий их направленного действия на различные клетки, вовлекаемые в процессы воспаления, нейродегенерации и репарации тканей (in vitro).

Основные планируемые результаты проекта:
1. Предлагаемый проект представляет интерес как с точки зрения создания новых эффективных средств для лечения травматических и ишемических повреждений тканей на основе пептидов–агонистов рецепторов ПАР1 иммобилизованных в полимерные носители, так и выявления новых механизмов направленного действия агонистов рецепторов семейства ПАР на различные клетки, вовлекаемые в процессы воспаления, нейродегенерации и репарации тканей (in vitro). В результате реализации проекта должны быть разработаны новые средства для лечения травматических и ишемических повреждений тканей на основе биодеградируемых материалов с иммобилизованными пептидами-агонистами рецепторов, активируемых протеиназами. Также должна быть получена научно-техническая и техническая документация, которая позволит проводить наработку стандартизованных экспериментальных образцов и выполнять исследовательские испытания полученных экспериментальных образцов.
2. Полученный препарат на основе пептида – агониста рецепторов ПАР1, освобождаемого АПС, иммобилизованного на разные формы полимерного носителя, должен обладать цитопротекторным, противовоспалительным и пролиферативным действиями. Защитное действие (активность) пептид должен демонстрировать как в нативной, растворённой форме, так и после высвобождения из полимерного носителя. Диапазон эффективных концентраций препарата не должен перекрываться с концентрациями, проявляющими побочные эффекты. Препарат должен демонстрировать максимально эффективное действие в низких концентрациях от наномолярных до микромолярных.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
1. Предполагается, что конечным продуктом, создаваемым с использованием результатов, планируемых при выполнении проекта, будут являться новые лекарственные препараты - средства для лечения травматических и ишемических повреждений тканей на основе биодеградируемых материалов с иммобилизованными пептидами-агонистами рецепторов, активируемых протеиназами. Еще одной областью применения результатов проекта может быть создание медицинских изделий для регенеративной медицины с включением разработанных препаратов в качестве составной части медицинского изделия для усиления регенеративного потенциала изделия.
2. Предлагаемый проект представляет интерес как с точки зрения создания новых эффективных средств для лечения травматических и ишемических повреждений тканей на основе пептидов–агонистов рецепторов ПАР1 иммобилизованных в полимерные носители, так и выявления новых механизмов направленного действия агонистов рецепторов ПАР на различные клетки, вовлекаемые в процессы воспаления, нейродегенерации и репарации тканей (in vitro).
Показано, что иммобилизованный в полимерные матриксы или биодеградабельные микрочастицы пептид-агонист ПАР1, освобождаемый тромбином, может имитировать пролиферативные свойства фермента в процессе регенерации ткани и ускорять заживление ран у мышей и крыс (Strukova et al., 2001, 2002, Markvicheva et al., 2006). Пептиды-агонисты ПАР-1, освобождаемые АПС, являются более дешевыми препаратами, по сравнению с рекомбинантным и модифицированным АПС, однако есть опасность их быстрого расщепляются пептидазами в организме. Иммобилизация пептидов в полимерные матрицы или микрочастицы позволяет защитить пептиды от разрушения, а также направленно регулировать скорость их выхода как в условиях in vitro так и in vivo. В связи с этим особую значимость приобретает правильный выбор полимерной матрицы. Использование полимерных матриц или микрочастиц на основе фиброинов шелка или полисахаридов – альгинатов и др. позволяет получать матрицы, которые являются не только биосовместимыми, но и биодеградируемыми, а, следовательно, могут быть предложены и для направленного лечения и восстановления функций разных клеток и тканей как после травмы и хирургических вмешательств, так и после ишемии мозга и др.органов.
Однако, до настоящего времени не были созданы эффективные формы пептидов во свойствами АПС и не было исследовано влияние этих пептидов и их иммобилизованных в полимерные носители форм, на функции клеток нейроваскулярной единицы мозга (тучные, астроциты и др.) и клеток, вовлекаемых в регуляцию процессов воспаления и репарации ткани (тучные, кератиноциты, фибробласты и др.) и сравнение его действия с действием протеиназы - АПС.
Препараты пептида-агониста ПАР1, освобождаемого АПС и их иммобилизованные в биосовместимые и биодеградируемые матрицы формы, защищающие клетки от гибели и восстанавливающие ткани, могут быть весьма перспективными среди лекарств для терапии травматических и ишемических повреждений тканей, в том числе мозга (при инсульте), заживления ран и язвы желудка.
3. Большинство используемых в терапии разных заболеваний лекарств имеют серьёзные недостатки, связанные с наличием многочисленных побочных эффектов и противопоказаний. Кроме того, лечение острых тяжелых заболеваний часто связано с ограничением терапевтического окна, в течение которого необходимо использовать лекарства. Сложная ситуация складывается при лечении инсультов и тяжелых воспалительных заболеваний и травм. В настоящее время для лечения ишемического инсульта, который вызван окклюзией сосуда, кроме классического применения антиоксидантов, антикоагулянтов и антиаггрегантов, используют технологию или механического удаления тромба (ов) в сосудах мозга или тромболитическую терапию с помощью тканевого активатора плазминогена (ТАП). ТАП- протеолитический фермент, (утвержденный ФДА (FDA) США) стимулирует лизис тромбов, активируя образование протеазы - плазмина, и восстановление кровотока (реперфузию) окклюзированного сосуда. Проводить целенаправленный тромболизис с помощью ТАП очень трудная и сложная задача из-за многообразия факторов риска. ТАП вызывает не только тромболизис, ангио- и нейрогенез, но также тяжелое побочное действие, приводя к нарушению гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), геморрагии и гибели нейронов мозга в моделях инсульта на животных (Zlokovic et al., 2011). Однако, как показали эксперименты на животных с экспериментальной ишемией мозга и первые доклинические исследования (в США), введение вместе с ТАП в острый период инсульта белка крови - активированного протеина С (АПС), блокирует вызванную ТАП гибель нейронов и стабилизирует ГЭБ (Adibhatla, 2008, Zlokovic, Griffin, 2011). АПС - полифункциональная протеиназа, антикоагулянт с цитопротекторным и противовоспалительным действием, которое реализуется через взаимодействие АПС с рецептором типа 1, активируемым протеиназами (ПАР1) и эндотелиальным протеина С рецептором (ЭПСР) (Mosnier et al., 2007). Препараты рекомбинантного АПС (рАПС, Зигрис) разрешены FDA (США) для лечения системного воспаления (сепсис) у детей и взрослых. Было показано, что рАПС снижает смертность больных с тяжелым сепсисом (Bernard, et al., 2001). Однако, недавно обнаружено, что ведение высоких концентраций рАПС на раннем этапе реперфузии не вызывало устойчивую нейропротекцию и не улучшало исход после глобальной ишемии головного мозга, остановки сердца и острого воспаления (Teschendorf et al., 2008, Breckner et al., 2013, Christians et al., 2013). Ранее обнаружено, что высокие концентрации АПС не оказывают цитопротекторного действия, а вызывают гибель культивируемых нейронов мозга крыс при эксайтотоксичности (модель ишемии мозга), также как высокие концентрации тромбина, тогда как низкие концентрации АПС защищают нейроны от гибели при нейротоксичности (Горбачева и др., 2006, 2008). АПС в низких концентрациях блокировал освобождение гистамина и других медиаторов воспаления тучными клетками, активированными острым воспалением, через активацию ПАР1 (in vitro) и ускорял репаративные процессы при заживлении экспериментальной язвы желудка у крыс (in vivo) (Макарова и др.2006, Русанова и др.2009).
4. Для достижения заявленных результатов исполнители строго следуют требованиям Технического задания и Плана-графика проекта. Унификация и стандартизация предполагаемых к созданию объектов, базируется на точном соблюдении разработанных и регламентированных методик получения и хранения экспериментальных образцов. Все экспериментальные работы выполняются в строгом соответствии с Программами и методиками исследовательских испытаний.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
1. Медицина и здравоохранение: Перспективные лекарственные кандидаты. Компоненты и системы направленной доставки лекарственных средств для повышения эффективности, улучшения фармакокинетических параметров и снижения токсичности лекарственных кандидатов, а также лабораторные протоколы их получения.
2. Предлагаемый проект представляет интерес как с точки зрения создания новых эффективных средств для лечения травматических и ишемических повреждений тканей на основе пептидов–агонистов рецепторов ПАР1 иммобилизованных в полимерные носители, так и выявления новых механизмов направленного действия агонистов рецепторов ПАР на различные клетки, вовлекаемые в процессы воспаления, нейродегенерации и репарации тканей (in vitro).
3. Поскольку проект направлен на разработку изделий медицинского назначения, предназначенных для лечения травматических и ишемических повреждений тканей, результаты проекта могут быть востребованы государственными и коммерческими организациями, деятельность которых связана с продвижением на рынок инновационных высокотехнологичных медицинских изделий и лекарственных препаратов. Потребителем разрабатываемых изделий медицинского назначения могут быть специализированные медицинские учреждения и отделы лечебных учреждений общего профиля, деятельность которых связана с лечением определенных заболеваний и повреждений различных органов.
4. Результаты данной работы и созданная технология могут быть использованы для создания лекарственных препаратов нового поколения, как в нашей стране, так и за рубежом. Создаваемая технология может быть востребована как научно-исследовательскими центрами, так и фармацевтическими компаниями, ведущими исследования в области создания новых медицинских средств.

Текущие результаты проекта:
При выполнении работ проекта были разработаны лабораторные технологические регламенты получения экспериментальных образцов препарата на основе пептида – агониста рецепторов ПАР1, освобождаемого АПС, иммобилизованного на разные формы полимерного носителя: покрытие, пленка, трехмерный матрикс; Программа и методики исследовательских испытаний синтезированных экспериментальных образцов препарата на основе пептида – агониста рецепторов ПАР1, освобождаемого АПС, иммобилизованного на разные формы полимерного носителя. По утвержденным регламентам синтезированы экспериментальные образцы. В соответствии с программой и методиками проведены сравнительные исследования разрабатываемых препаратов. В ходе проведенных исследований показано, что иммобилизация пептида-агониста рецепторов ПАР1, освобождаемого АПС, на разные формы носителей не влияет на его биологическую активность в отношении культивируемых клеток кожи (кератиноцитов и фибробластов). Как и нативный пептид-агонист рецепторов ПАР1, освобождаемого АПС, иммобилизованные формы пептида стимулируют пролиферацию первичных кератиноцитов человека и эпидермалных клеток линии НаСаТ и стимулируют закрытие раны эпителиального пласта. Также в результате экспериментальных исследований установлено, что тип носителя не влияет на биологическую активность пептида-агониста рецепторов ПАР1, освобождаемого АПС.
По результатам проведенных исследований установлено, что характер биологической активности пептида-агониста рецепторов ПАР1, освобождаемого АПС, зависит от типа модели, в которой он используется. В модели системного воспаления, где в качестве объекта использовали перитониальные тучные клетки, иммобилизация пептида-агониста рецепторов ПАР1, освобождаемого АПС, на полимерные носители не приводила к инвертированию его эффекта, хотя и изменяла его выраженность. В тоже время использование в качестве модели нейровоспаления активированных тромбином культивируемых астроцитов, показало смену действия пептида-агониста рецепторов ПАР1, освобождаемого АПС, по направленности. Возможно, что в используемой в экспериментах модели нейровоспаления иммобилизация пептида повышает его эффективность, т.к. наблюдаемый эффект синтезированного пептида-агониста рецепторов ПАР1, освобождаемого АПС, в концентрации 30 мкМ соотносится с потенцирующим эффектом нативного пептида в концентрации 500 мкМ. В ходе выполнения экспериментальных работ этапа показано:
1. Синтезированный пептид-агонист рецепторов ПАР1, освобождаемого АПС, подобно протеазе АПС, стимулирует пролиферативную активность кератиноцитов человека, но в концентрации на несколько порядков выше концентрации протеазы АПС. Максимальная эффективная концентрация исследуемого пептида – 10 мкМ, АПС – 1 нМ.
2. Анализ рецепторного механизма действия синтезированного пептида-агониста рецепторов ПАР1, освобождаемого АПС, на пролиферативную активность кератиноцитов в сравнении с действием протеазы – АПС, выявил участие ПАР1 и корецептора ЭПСР в действии обоих агонистов – синтезированного пептида-агониста рецепторов ПАР1, освобождаемого АПС, и АПС.
3. Исследуемый пептид-агонист рецепторов ПАР1, освобождаемого АПС, подобно протеазе АПС стимулирует закрытие ран эпителиального пласта. Временные характеристики стимулирующего действия пептида и АПС совпадают: 10 мкМ для пептида и 1 нМ АПС ускоряют ранозаживление уже через 24 часа после нанесения раны.

По результатам текущего и предыдущих этапов опубликовано 3 статьи, еще одна подготовлена к печати. Результаты проекта были доложены на 5 конференциях российских и международных. Также по результатам проекта подготовлены 2 заявки на изобретение на патент РФ.