Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка ингибиторов ферментов репарации ДНК в качестве прототипов лекарственных препаратов для социально значимых заболеваний

Номер контракта: 14.604.21.0018

Руководитель: Лаврик Ольга Ивановна

Должность руководителя: Уполномоченное лицо

Докладчик: Захаренко Александра Леонидовна, Уполномоченное лицо

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
ингибиторы parp, ингибиторы tdp1, сенсибилизатор к действию противоопухолевых препаратов, поли(адф-рибозо)полимераза, тирозил-днк-фосфодиэстераза 1

Цель проекта:
Проект направлен на решение проблемы резистентности опухолевых клеток к химиотерапии, возникающей из-за способности клеток адаптировать свой ответ на повреждения ДНК к воздействию терапевтических агентов. Поиск ингибиторов ключевых ферментов и факторов репарации ДНК относится к перспективным направлениям медицинской химии и является одним из путей создания эффективной терапии сердечно-сосудистых, нейродегенеративных и онкологических заболеваний. Перечисленные патологии связаны с нарушениями экспрессии белков репарации, в том числе их гиперэкспрессией. Тирозил-ДНК-фосфодиэстераза1 (Tdp1) является перспективной мишенью для лечения онкологических и нейродегенеративных заболеваний. Tdp1 играет важную роль в удалении повреждений ДНК, создаваемых топоизомеразой 1 (Top1), ее ингибитором камптотецином и антираковыми препаратами. Tdp1 расщепляет 3’-диэфирную связь между остатком тирозина и 3’-концом ДНК, а также удаляет другие повреждения с 3’-конца ДНК. Таким образом, Tdp1 противостоит ингибиторам Тор1, которые являются достаточно эффективными антираковыми препаратами. Предполагается, что именно Tdp1 ответственна за лекарственную устойчивость некоторых видов рака. Таким образом, сочетание препаратов, воздействующих на Тор1 и Tdp1, может существенно повысить эффективность химиотерапии. Цель проекта: "Поиск низкомолекулярных ингибиторов ключевых ферментов репарации ДНК {тирозил-ДНК-фосфодиэстераза 1 (Tdp1) и поли(АДФ-рибозо)полимеразы 1 и 2 (PARP1/2)} и исследование активности наиболее эффективных соединений по отношению к выделенным ферментам и в культуре клеток."

Основные планируемые результаты проекта:
В результате выполнения проекта планируется с помощью методов молекулярного моделирования и экспериментальных подходов выявить новые оригинальные ингибиторы Tdp1, эффективно подавляющие пролиферацию опухолевых клеток и в виде монопрепарата или в сочетании с клинически используемыми противораковыми лекарствами и являющиеся прототипами противоопухолевых препаратов.
Перечень ожидаемых научно-технических результатов:
Экспериментальные образцы соединений, обладающих ингибиторной активностью по отношению к Tdp1.
Лабораторные методики синтеза соединений
Лабораторная методика определения ингибиторных свойств соединений в реакции, катализируемой рекомбинантной Tdp1
Данные компьютерного моделирования фермент-ингибиторных комплексов
Данные по определению механизма действия соединений на активность ферментов
Данные по определению селективности соединений-лидеров по отношению к Tdp1.
Данные по определению влияния наиболее перспективных из найденных ингибиторов на клеточные культуры.

Молекулярный докинг соединений при компьютерном скрининге осуществляется с помощью программ Lead Finder, AmberTools, Amber.
Используемые для получения потенциальных ингибиторов Tdp1 методы синтеза и очистки обеспечивают высокую чистоту получаемых целевых соединений (95%). Структура и чистота полученных соединений подтверждена с помощью ЯМР.
Скрининг соединений, являющихся потенциальными ингибиторами, проводится методом детекции флуоресценции в режиме реального времени, позволяющим определять начальную скорость реакции с высокой точностью.
Определение концентрации вещества, при которой наблюдается подавление активности фермента на 50%, (IC50) проводится с точностью не менее 20%.
Обнаруженные ингибиторы Tdp1 обеспечивают подавление ее активности наполовину при концентрациях от 0,045 до 70 мкМ. Структуры изученных классов соединений – ингибиторов Tdp1 предусматривают возможности химической модификации, направленной на получение нужных свойств (усиление ингибиторного эффекта, усиление цитотоксичности в отношении опухолевых клеток, повышение селективности, снижение числа и интенсивности побочных эффектов и т.д.).

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
Созданы более эффективные ингибиторы Tdp1 по сравнению с существующими. Среди обнаруженных ингибиторов часть соединений обладают незначительной цитотоксичностью, что позволяет рассматривать их как перспективные для создания сенсибилизаторов опухолевых клеток к действию ДНК-повреждающих агентов (в частности, камптотецина и его клинических производных).

Все изученные соединения рассматриваются как ингибиторы Tdp1 впервые в мире.
Разработанная методика определения ингибиторных характеристик соединений в отношении очищенного фермента Tdp1, основанная на использовании флуоресцентного олигонуклеотида, требует меньших затрат на синтез олигонуклеотидов и меньшего количества манипуляций по сравнению с имеющимися.
Обнаруженные ингибиторы Tdp1 на основе гидразинотиазолов усниновой кислоты являются наиболее эффективными на сегодняшний день.
Впервые разработан ряд методов синтеза потенциальных ингибиторов Tdp1 – производных усниновой кислоты и адамантана
Впервые показано, что обнаруженный ранее ингибитор ПАРП1 7-метилгуанин в концентрации 150 мкМ не токсичен сам по себе, но усиливает цитостатическое действие цисплатина и доксорубицина на клеточные линии HCC1937 (рак молочной железы) и HCT116 (рак толстой кишки).

В литературе описано не очень много ингибиторов Tdp1 различной эффективности (в диапазоне значений IC50 100-0,4 мкМ) [Antony et al., 2007; Dexheimer et al., 2008; Nguyen et al, 2012; Marchand et al., 2009]. Обнаружен класс соединений – производных иденоизохинолина, - подавляющих активность как Tdp1, так и Тор1 в микромолярных концентрациях [Conda-Sheridan et al., 2013; Nguyen et al, 2012; Nguyen et al, 2015]. Эти соединения обладают значительной цитотоксичностью (в субмикромолярном диапазоне концентраций) по отношению к ряду опухолевых клеточных линий (там же). Для остальных известных ингибиторов Tdp1 определение цитотоксичности не проводилось.

Обнаруженные в ходе выполнения настоящего проекта ингибиторы Tdp1 подавляют активность этого фермента в диапазоне концентраций от 0,045 мкМ (гидразинотиазоловое производное усниновой кислоты) до микромолярных (адамантаны). Таким образом, эффективность соединения-лидера превышает опубликованное наилучшее значение в 10 раз. Для каждого из обнаруженных химических классов ингибиторов Tdp1 определена цитотоксичность минимум на двух клеточных линиях. Среди разработанных ингибиторов есть как умеренно токсичные (производные пентатиепина и усниновой кислоты, цитотоксичность в микромолярном диапазоне концентраций), так и нетоксичные соединения (адамантаны, нетоксичны в концентрации 100 мкМ).

Терапевтическим эффектом таких веществ может быть селективное увеличение активности ингибиторов Top1 в опухолях с нарушениями в процессах репарации ДНК и контроля клеточного цикла. Нетоксичные ингибиторы Tdp1 представляют особый интерес, т.к. позволят избегать дополнительных побочных эффектов.

Antony, S et al., Nucleic Acids Res. 2007, 35, 4474−4484.
Conda-Sheridan M., et al., J. Med. Chem., 2013, 56, 182-200.
Dexheimer TS, et al., Anticancer Agents Med Chem. 2008, 8, 381–389.
Nguyen TX, et al., J. Med. Chem., 2012, 55, 4457−4478.
Nguyen TX, et al., J. Med. Chem., 2015, 58, 3188−3208.
Marchand C. et al., Mol Cancer Ther, 2009, 8, 240–248.

Способы достижения поставленных результатов:

1. Создание компьютерных библиотек новых потенциальных ингибиторов Tdp1, PARP1/2 среди разных классов природных и синтетических соединений.
В проекте используется сочетание биоинформационных подходов, позволяющих проводить скрининг и моделирование взаимодействий низкомолекулярных соединений с Tdp1/PARP1/2, с методами экспериментальной проверки ингибирующего эффекта отобранных соединений на выделенных препаратах ферментов и на клеточных линиях. Для молекулярного моделирования комплексов Tdp1, PARP1 и PARP2 с ингибиторами используются вычислительные мощности суперкомпьютера СКИФ МГУ «Чебышев» и современное программное обеспечение для молекулярного докинга и молекулярной динамики (Lead Finder, AmberTools, Amber).
Создаются компьютерные библиотеки новых потенциальных ингибиторов в ряду различных синтетических и природных соединений и проведен компьютерный скрининг данных библиотек с целью отбора наиболее эффективных ингибиторов.
2. Скрининг библиотек с использованием полноатомных моделей ферментов и методов молекулярного докинга и структурной фильтрации, отбор наиболее перспективные соединения для экспериментального исследования.
В ходе скрининга используется разработанный авторами подход структурной фильтрации предсказанных позиций ингибиторов в активном центре, позволяющий увеличить эффективность предсказания путем отсева ложноположительных результатов (Захаренко и др., Молекуляр. биология 2011, 45, 565-569).
3. Молекулярно-динамическое моделирование механизма связывания наиболее перспективных ингибиторов с ферментом.
Для наиболее перспективных ингибиторов будет произведено молекулярно-динамическое моделирование с целью уточнения механизма связывания с ферментом.
4. Синтез отобранных соединений.
Применяются современные методики тонкого органического синтеза, физико-химические методы установления строения и подтверждения высокой оптической чистоты полученных соединений.
5. Характеризация способности отобранных синтезированных соединений подавлять активность выделенных препаратов Tdp1, PARP1/2, отбор наиболее перспективных ингибиторов для испытания на клеточных моделях онкологических заболеваний.
Игнибиторные свойства синтезированных соединений изучаются с использованием методик для определения ингибиторных свойств соединений в реакции автополи(АDP-рибозил)ирования, катализируемой рекомбинантными PARP1 и PARP2, разработанных коллективом ранее [Захаренко, 2011], в реакции, катализируемой рекомбинантной Tdp1 – с использованием адаптированной методики [Jensen, 2013].
6. Характеризация способности потенциальных ингибиторов Tdp1, PARP1/2 подавлять пролиферацию опухолевых клеток как в качестве монореагента, так и в при совместном использовании с препаратами, применяемыми в клинической практике для противоопухолевой терапии.
Проводится экспериментальное изучение влияния отобранных производных на пролиферацию перевиваемых линий опухолевых клеток. Оценка клеточной гибели проводится на проточном цитометре по методике измерения популяции sub-G1 или с помощью МТТ теста.
7. Компьютерное моделирование фармакокинетических свойств и токсичности наиболее перспективных ингибиторов.
Моделирование фармакокинетических свойств и токсичности будет проведено с использованием пакета программ ACD/Labs.

Ограничения и риски:
К рискам можно отнести низкий терапевтический индекс, наличие побочных эффектов, неудовлетворительные фармакологические свойства

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Полученная информация может быть положена в основу разработки лекарственных препаратов противоопухолевого действия.
Требуется определить влияние обнаруженных ингибиторов на ферменты, проварьировав ряд условий: тип кофакторов, наличие дополнительных вспомогательных белков, наличие повреждений ДНК или модификаций ферментов (поли(АДФ-рибозил)ирование, фосфорилирование, убиквитинилирование и т.д.). Для выяснения биологической активности предполагаемых ингибиторов Tdp1 представляется целесообразным исследовать влияние этих соединений на культуры клеток различного происхождения, а также животные модели различных заболеваний, связанных с функционированием указанного фермента. Кроме того, целесообразно будет провести направленные трансформации соединений-лидеров с целью получения более эффективных ингибиторов Tdp1.
Созданные на основе разрабатываемых ингибиторов Tdp1 препараты предположительно могут изменить структуру производства и потребления лекарственных препаратов в пользу отечественных производителей. Ожидается, что применение разрабатываемых ингибиторов Tdp1 приведет к более эффективным и безопасным схемам лечения онкологических заболеваний.

Текущие результаты проекта:
1. Разработана методика определения ингибиторных характеристик соединений в отношении очищенного фермента Tdp1, основанная на использовании флуоресцентного олигонуклеотида. Методика предназначена для скрининга библиотек соединений в формате реального времени.
2. Созданы компьютерные библиотеки классов природных и синтетических соединений - производных усниновой кислоты и адамантана - для проведения скринига потенциальных ингибиторов ферментов репарации ДНК. Проведен компьютерный скрининг библиотек потенциальных ингибиторов. В результате скрининга отобран ряд производных адамантана и усниновой кислоты для последующей экспериментальной проверки их ингибирующей активности в отношении Tdp1.
3. Разработаны методы синтеза потенциальных ингибиторов:
а) методики для синтеза на основе усниновой кислоты производных, содержащих различные структурные фрагменты:
i) тиазольный цикл
ii) флавоноидные фрагменты, в том числе открытоцепочечные соединения – хальконы, и гетероциклические – ауроны и флаваноны
iii) енаминопроизводные с варьированием типа заместителя
iv) сульфидные и сульфоновые фрагменты
б) методики для синтеза производных на основе адамантана:
i) 1- и 2-аминоадамантанов
ii) диазаадамантан-6-она.
Синтезированы отобранные в результате виртуального скрининга соединения. Из 52 синтезированных соединений 20 новых, 32 известных. Чистота полученных соединений не менее 95%.
4. Проведено предварительное определение ингибиторных характеристик соединений – производных пентатиепина, адамантана и усниновой кислоты по отношению к Tdp1. Обнаружены ингибиторы в диапазоне концентраций от 0,045 до 70 мкМ, внутри каждого химического класса обнаружены зависимости ингибиторной активности от структуры соединений. Данные соединения обладают ингибиторными характеристиками, соответствующими мировому уровню, одно из них – наиболее эффективный ингибитор Tdp1, известный на сегодняшний день (значение IC50 45 nM).
5. Обнаружено, что исследованные соединения-лидеры являются бесконкурентными ингибиторами Tdp1.
6. Показано, что все обнаруженные ингибиторы Tdp1 не влияют на активность ферментов эксцизионной репарации оснований, либо оказывают незначительное влияние.
7. Проведено сопоставление расчетных и экспериментальных параметров ингибирования. Показано, что расчетные значения констант ингибирования хорошо согласуются с экспериментальными значениями IC50.
8. Проведено предварительное изучение влияния обнаруженных ингибиторов Tdp1 на культуры опухолевых клеток. Обнаружены умеренно цитотоксичные и нетоксичные вещества. Для некоторых енаминовых производных усниновой кислоты показано снижение значения СС50 (концентрация, необходимая для подавления клеточного роста наполовину) для камптотецина.
9. Проведено экспериментальное изучение влияния 7-метилгуанина на пролиферацию опухолевых клеток. Показано, что 7-метилгуанин в концентрации 150 мкМ не токсичен сам по себе, но усиливает цитостатическое действие цисплатина и доксорубицина на клеточные линии HCC1937 (рак молочной железы) и HCT116 (рак толстой кишки). Таким образом, 7-метилгуанин способен усиливать эффективность существующих химиопрепаратов в случае комбинированного использования. Перспективным представляется провести доклинические испытания 7-метилгуанина в качестве антиракового препарата в сочетании с ДНК-повреждающими агентами, использующимися в клинической практике.
10. Проведено компьютерное моделирование фармакокинетических свойств и токсичности наиболее перспективных ингибиторов Tdp1. Показано, что соединения – производные адамантана обладают наилучшим среди исследуемых классов токсикологическим и фармакокинетическим профилем.

По результатам проекта опубликованы две статьи
Zakharenko A, Khomenko T, Zhukova S, Koval O, Zakharova O, Anarbaev R, Lebedeva N, Korchagina D, Komarova N, Vasiliev V, Reynisson J, Volcho K, Salakhutdinov N, Lavrik O. Synthesis and biological evaluation of novel tyrosyl-DNA phosphodiesterase 1 inhibitors with a benzopentathiepine moiety. Bioorg Med Chem. 2015 23, 2044-2052. doi: 10.1016/j.bmc.2015.03.020.

Zakharenko A. L., Ponomarev K. U., Suslov E. V., Korchagina D. V., Volcho K. P., Vasil’eva I. A., Salakhutdinov N. F., Lavrik O. I. Inhibitory Properties of Nitrogen-Containing Adamantane Derivatives with Monoterpenoid Fragments against Tyrosyl-DNA Phosphodiesterase 1. Rus. J. Bioorg. Chem., 2015, 41, 657–662. DOI: 10.1134/S1068162015060199

Оформлены и зарегистрированы две заявки на изобретения:
Заявка на изобретение «Средство для ингибирования фермента тирозил-ДНК-фосфодиэстеразы 1 человека» №2014139787, дата приоритета 30.09.2014. Авторы Хоменко Т.М., Волчо К.П., Захаренко А.Л., Жукова С.В., Анарбаев Р.О., Лаврик О.И., Салахутдинов Н.Ф.

Заявка на изобретение «Средство для ингибирования фермента тирозил-ДНК-фосфодиэстеразы 1 человека» №2015144391, дата приоритета 15.10.2015. Авторы Захаренко А.Л., Лебедева Н.А., Лузина О.А., Салахутдинов Н.Ф., Лаврик О.И.