Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка системы генетических маркеров X-хромосомы для ДНК-идентификации в криминалистике и судебной медицине.

Номер контракта: 14.604.21.0019

Руководитель: Степанов Вадим Анатольевич

Должность: зам. директора

Организация: Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук"
Организация докладчика: Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт медицинской генетики"

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
днк-идентификация, x-хромосома, однонуклеотидный полиморфизм, судебная медицина, популяционные данные

Цель проекта:
Генотипирование ДНК является наиболее доказательным методом анализа биологического материала при производстве судебно-медицинской идентификационной экспертизы. Молекулярно-генетический идентификационный анализ позволяет исследовать особые участки ДНК, строго специфичные для каждого индивидуума, и получить, таким образом, уникальный генетический “паспорт” человека, которое нельзя скрыть, изменить или подделать. Индивидуализирующие признаки, определяемые на уровне ДНК, характеризуются почти абсолютной устойчивостью, то есть сохраняются в организме человека неизменными всю его жизнь. ДНК-идентификация в криминалистике и судебной медицине основывается на анализе частоты встречаемости различных маркерных ДНК-локусов, локализованных в аутосомах, половых хромосомах (Y-хромосоме и X-хромосоме) и митохондриальной ДНК в различных биологических образцах. Анализ Y-хромосомы и (или) мтДНК необходим в случаях, когда нужно установить родственные отношения по отцовской или материнской линиям; используется при работе с сильно деградированными образцами ДНК вследствие очень высокой копийности мтДНК; а также может быть альтернативой ДНК-идентификации по аутосомным локусам; ДНК-идентификация по аутосомным локусам в подавляющем большинстве случаев проводится по стандартизованным наборам аутосомных микросателлитов (коротких тандемных повторов), или STR (Животовский, 2003, 2006). Для Y-хромосомы обычно используют «минимальный» гаплотип, состоящий из 11 или 17 STR-локусов (Y-STR). Для мтДНК применяют секвенирование гипервариабельных сегментов (ГВС) I и (иногда) II и дополнительное генотипирование некоторых точечных (SNP) мутаций вне ГВС методами ПЦР-ПДРФ (Carracedo et al., 2000). Каждый из этих типов маркеров имеет как ряд преимуществ, так и недостатков, которые снижают их информативность в некоторых сложных случаях (Иванов, 2001, 2008; Животовский, 2003; Перепечина, 2012). Введение в широкое использование тест-системы основанной на X-хромосомных маркерах позволит решит эту проблему. Так в случаях определения родства между отцом и дочерью, и бабушкой по отцу и внучкой маркеры X-хромосомы превосходят возможности аутосомных, в два и четыре раза соответственно, применение Y-хромосомных и маркеров мтДНК в данном случае бесполезно. Популяционно-генетические данные являются основополагающими для ДНК-идентификации. Вероятностная оценка достоверности выводов генетической экспертизы проводится на основе данных о частотах аллелей генетических маркеров в референтной популяции. При этом принимается, что популяция является большой, однородной, в которой осуществляется свободной скрещивание в течение многих поколений (популяция находится в состоянии равновесия Харди-Вайнберга), а используемые локусы находятся в равновесии по сцеплению. Представленные характеристики варьируют от выборки к выборке, потому выявленные данные об используемых маркерах не могут быть автоматически экстраполированы на другие популяции, нельзя игнорировать взаимодействие между различными популяционно-специфическими факторами. Отклонение реальной популяции от этих допущений приводит к необходимости внесения изменений в вероятностные расчеты применяемые в ДНК-идентификации. Существующие, на настоящее время, генетические тест-системы, используемые в практике экспертно-криминалистических служб, как за рубежом, так и в России, разработаны на основании данных о генетическом разнообразии США и стран Европы. Наиболее информативными для генетической экспертизы в России являются те тест-системы, которые были адаптированы для использования на территории России или же разрабатывались на основе данных о генетическом разнообразии населения РФ. Использование генетических систем ДНК-идентификации без учета генетической специфичности популяции, из которой происходит исследуемый ДНК-профиль, снижает достоверность выводов. Цель реализуемого проекта: Разработать тест-систему SNP-маркеров Х-хромосомы для ДНК-идентификации в популяциях России на основанной на мультиплексном генотипировании методом мультиплексной ПЦР и MALDI-TOF масс-спектрометрии, а также создать базу данных референтных частот SNP-маркеров Х-хромосомы для популяций России.

Основные планируемые результаты проекта:
В настоящей работе охарактеризована генетическая структура ряда популяций Евразии по Х-хромосомным SNP-маркерам . На основе полученных данных выполнена оценка идентификационной информативности исследуемых маркеров для каждой изученной популяции индивидуально. Анализ частот аллелей показал, что для популяций, проживающих на территории Российской Федерации и ближнего зарубежья, относящихся к европеоидному расовому типу характерен спектр частот типичный для популяций Европы, к монголоидному расовому типу – типичный для популяций Восточной Азии. Оценка ожидаемой гетерозиготности и уровня популяционной дифференциации показала снижение уровня генетического разнообразия и увеличение генетической дифференциации популяций в направлении с запада на восток. При этом 28% генетической вариабельности однонуклеотидных маркеров объясняется географическими различиями популяций. В целом, уровень популяционной дифференциации Х-хромосомных маркеров превосходит таковой по аутосомным микросателлитам. Таким образом, Х-маркеры являются наилучшими кандидатами для формирования идентификационной панели позволяющей определять этническую принадлежность. На основе полученных данных о генетическом разнообразии и частотах аллелей была сформирована панель однонуклеотидных полиморфных маркеров наиболее информативных для ДНК-идентификации в российских популяциях, а также создана референсная база данных частот аллелей, что позволяет проводить расчеты частот встречаемости генотипов при идентификации личности и установлении биологического родства. В пространстве главных компонент, среди изученных популяций выделяются два кластера: европеоидный и монголоидный. При этом показана общность генофонда сибирских татар (Томск), относящихся к уральскому расовому типу, с европеоидами, русскими в частности. Популяции хантов, также относящиеся к уральскому расовому типу показали преобладание монголоидной компоненты в их генофонде. Проведенный анализ структуры неравновесия по сцеплению отразил различия в характере сцепления в различных популяциях. Учет этих данных позволил скорректировать панель наиболее информативных маркеров для каждой популяции. Анализ идентификационного потенциала отразил необходимость учета частот гаплотипов однонуклеотидных полиморфных маркеров в популяциях хакасов и бурят. В целом информативность X-SNP системы достигла высоких показателей и не только не уступает информативности панели юридически закрепленных аутосомных микросателлитных маркеров, но и превосходит ее в некоторых случаях.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
В состав тест-системы было отобрано 64 SNP-маркера Х-хромосомы, обладающие наибольшей информативностью для ДНК-идентификации в популяциях Российской Федерации. Набор состоит из двух групп маркеров способных к мультиплексированию. Один мультиплекс включает в себя 35 однонуклеотидных полиморфных маркеров Х-хромосомы, второй мультиплекс включает в себя 29 однонуклеотидных полиморфных маркеров Х-хромосомы. Статистический анализ данных о генетическом разнообразии популяций России по данному набору маркеров показал, что патентуемый набор обладает высоким идентификационным потенциалом. Информативность патентуемого набора однонуклеотидных полиморфных маркеров х-хромосомы в популяции русских, превосходит возможности существующих систем ДНК-идентификации. Уровень вероятности дискриминации неродственных индивидов (PD) составил 0,99999999999999999999999986 для женщин и 0,999999999999999986 для мужчин. Возможным способом генотипирования тест-системы является методика проведения MALDI-TOF масс-спектрометрии предложенная фирмой Agena Bioscience (ранее Sequenom Bioscience). Методика включает в себя ряд реакций (ПЦР, SAP-реакция, iPLEX-реакция) с последующим анализом амплификата с помощью генетического анализатора «MassARRAY Analyzer 4». Данная методика проведения генотипирования обладает высокой чувствительностью, высокой пропускной способностью, а также является экономически выгодной, что является преимуществом для практического применения.
Сравнение разработанной системы X-SNPid с существующими на настоящий момент аналогами показало, что разработанная в настоящей работе панель X-сцепленных однонуклеотидных маркеров по технологичности превосходит все имеющиеся аналоги, кроме систем, базирующихся на технологии массового параллельного секвенирования (MPS), которые на настоящий момент затратны.
Наиболее близким аналогом системы предложенной в данной работе является 53 XSNP(Li., 2015). Однако данная система имеет небольшую емкость мультиплексов (17-18 маркеров) и требует 4 отдельных мультиплексных ПЦР, что сопряжено с большими финансовыми затратами. К тому же вероятность дискриминации неродственных индивидов для XSNPid на несколько порядков превышает таковую в 53 XSNP.


Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Полученные результаты обладают широкими перспективами для практического использования в криминалистике и судебной медицине. Наиболее полезны маркеры Х-хромосомы при тестировании родства, а также при непрямой молекулярно-генетической идентификации личности. Специфика механизма наследования Х-хромосомы наделяет Х-хромосомные маркеры уникальными особенностями увеличивающими информативность тест-системы в случаях сложного тестирования родства: в случаях определения родства между отцом и дочерью, когда ДНК предполагаемого отца не доступна; в случаях определения отцовства между близкими родственниками, например двумя братьями или отцом и сыном (Szibor, 2007); в случаях, когда доступна только ДНК предполагаемых сводных сестер, поскольку они имеют общую X- хромосому, полученную от отца; в случаях инцеста (Szibor, 2007) и.т.д. Также разработанная в данном исследовании панель генетических маркеров может быть полезна при опознании тел жертв военных действий, массовых катастроф, терактов, в частности, при идентификации останков военнослужащих, погибших в ходе Второй мировой войны, особенно в тех случаях, когда Y-хромосомные маркеры неинформативны. При этом именно X-SNP система маркеров является наиболее предпочтительной в случае идентификации останков большого срока давности, за счет того, что SNP маркеры более удобны в работе с деградированной ДНК.
Разработанные в рамках настоящего контракта тест-системы могут быть внедрены в лабораториях ДНК-диагностики и криминалистических лабораториях, оборудованных автоматическими ДНК-анализаторами «MassARRAY Analyzer 4» или аналогичными масс-спектрометрами MALDI-TOF . Разработанные тест-системы могут быть использованы также в научных лабораториях в исследовательских целях (изучение генетического разнообразия популяций человека). Прикладное значение таких исследований заключается в пополнении баз данных, которые используются для расчета вероятности случайного совпадения генотипов у неродственных индивидов. Внедрение разработанных в рамках настоящего контракта тест-систем должно обеспечивать следующие социально-экономические эффекты:сокращение сроков генетической идентификации личности в криминалистике и судебной медицине; уменьшение риска ошибок при установлении родственных связей, в том числе при исследовании случаев спорного отцовства; оптимизацию условий генотипирования для научных исследований в области популяционной генетики человека и медицинской генетики.

Текущие результаты проекта:
Аналитический обзор современной научно-технической литературы, а также анализ результатов аналогичных исследований по разработке тест-систем для ДНК-идентификации позволил установить, что оптимальным вариантом для решения поставленных задач является использование технологии MALDI-TOF масс-спектрометрии. Подходы, основанные на низкоплотных микроматрицах ДНК или на SNaPShot-анализе с помощью капиллярного гель-электрофореза, остаются относительно слабо востребованными из-за ограничений по возможности мультиплексирования и ограничений разрешающей способности этих методов для разделения продуктов ПЦР. Метод MALDI-TOFF масс-спектрометрии обладает очень высоким разрешением, что позволяет отличить сигнал детекции исследуемых образцов ДНК от неспецифического фона, в результате чего данный метод обладает очень высокой чувствительностью. Кроме того, выбранный метод также обладает и значительной призводительностью. Поскольку время анализа одного образца занимает несколько миллисекунд, а максимальное число маркеров в мультиплексе достигает 40, данный метод позволяет менее чем за час, получить сведения о 15360 индивидуальных генотипов по SNP-маркерам. Возможность проведения одномоментного генотипирования до 40 маркеров позволяет использовать данную методику для ДНК-идентификации биологических образцов и создавать высокоинформативные тест-системы. Проведенный отбор информативных SNP-маркеров Х-хромосомы позволил сформировать набор, включающий 66 SNP, которые демонстрируют высокие показатели гетерозиготности и генетической дифференциации в популяциях населения России, не входят в совместные блоки сцепления и, таким образом, наиболее информативны для ДНК-идентификации. Большинство отобранных SNP-маркеров Х-хромосомы локализуется в межгенных регионах (64,3%), остальные 35,7% расположены в некодирующих белки регионах 22 различных генов. Уровень ожидаемой
гетерозиготности выбранных SNP варьирует от 0,495781 до 0,492502. Разработана методика проведения MALDI-TOF масс-спектрометрии набора SNP-маркеров X-хромосомы. В основе разработанной методики мультиплексного генотипирования набора SNP-маркеров Х-хромосомы с помощью технологии MALDI-TOF масс-спектрометрии лежит анализ отличий масс продуктов амплификации альтернативных аллелей. Разработана методика проведения мультиплексной ПЦР набора SNP-маркеров X-хромосомы. В рамках разработанной методики получены два мультиплексных набора для генотипированяи SNP: первый, включающий 36 SNP-маркеров Х-хромосомы и второй, содержащий 30 SNP-маркеров Х-хромосомы. Для каждого из маркеров было подобрано 2 ПЦР-праймера (прямой и обратный) и пролонгирующий праймер для iPLEX-реакции. Разработаны требования к разрабатываемой тест-системе (технические характеристики, требования к эффективности, экономичности, воспроизводимости и т.д.), определяемые их назначением, условиями эксплуатации и применения. Разработан лабораторный регламент изготовления тест-системы для идентификации личности по ДНК маркерам Х-хромосомы. Плучены генотипы индивидов принадлежащих к популяциям русских, сибирских татар, хантов, хакасов, казахов, бурятов, тувинцев. Выполнена верификация данных генотипирования образцов ДНК с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии путем секвенирования анализируемых локусов ДНК Х-хромосомы в контролькной группе образцов. В 100% наблюдений подтверждены генотипы двух вариантов гомозигот и гетерозигот по всем
шестидесяти шести Х-хромосомным SNP-маркерам. Разработана методика применения разработанной тест-системы на основе SNP-маркеров Х-хромосомы. Проведена валидация разработанной тест-системы, согласно которой тест-система соответствует заявленным требованиям. Оценка идентификационного потенциала разрабатываемой системы маркеров показала, что система обладает высокой информативностью и может быть использована на территории РФ. Проведен статистический анализ полученных результатов. Анализ частот аллелей показал, что для популяций, проживающих на территории Российской Федерации и ближнего зарубежья, относящихся к европеоидному расовому типу характерен спектр частот типичный для популяций Европы, к монголоидному расовому типу – типичный для популяций Восточной Азии. Оценка ожидаемой гетерозиготности и уровня популяционной дифференциации показала снижение уровня генетического разнообразия и увеличение генетической дифференциации популяций в направлении с запада на восток. При этом 28% генетической вариабельности однонуклеотидных маркеров объясняется географическими различиями популяций. В целом, уровень популяционной дифференциации Х-хромосомных маркеров превосходит таковой по аутосомным микросателлитам. Таким образом, Х-маркеры являются наилучшими кандидатами для формирования идентификационной панели позволяющей определять этническую принадлежность. На основе полученных данных о генетическом разнообразии и частотах аллелей была сформирована панель однонуклеотидных полиморфных маркеров наиболее информативных для ДНК-идентификации в российских популяциях, а также создана референсная база данных частот аллелей, что позволяет проводить расчеты частот встречаемости генотипов при идентификации личности и установлении биологического родства. В пространстве главных компонент, среди изученных популяций выделяются два кластера: европеоидный и монголоидный. При этом показана общность генофонда сибирских татар (Томск), относящихся к уральскому расовому типу, с европеоидами, русскими в частности. Популяции хантов, также относящиеся к уральскому расовому типу показали преобладание монголоидной компоненты в их генофонде. Проведенный анализ структуры неравновесия по сцеплению отразил различия в характере сцепления в различных популяциях. Учет этих данных позволил скорректировать панель наиболее информативных маркеров для каждой популяции. Анализ идентификационного потенциала отразил необходимость учета частот гаплотипов однонуклеотидных полиморфных маркеров в популяциях хакасов и бурят. Разработаны предложения и рекомендации по внедрению разрабатываемой тест-системы в крминалистике и медицине. Создана база данных по референтным частотам в популяциях России и направлена на регистрацию в ФИПС. Подана заявка на получение патента на разработанную тест-систему.