Регистрация / Вход
Прислать материал

Научное обоснование и экспериментальная разработка клеточной биотехнологии программирования фенотипа переключения у макрофагов для терапии рака

Номер контракта: 14.604.21.0020

Руководитель: Малышев Игорь Юрьевич

Должность: Зав.кафедрой

Организация: федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова" Министерства здравоохранения Российской Федерации
Организация докладчика: государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова" Министерства здравоохранения Российской Федерации

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
макрофаг, опухоль, репрограммирование, биотехнология, цитокины, факторы транскрипции

Цель проекта:
1. Формулировка задачи/проблемы, на решение которой направлен реализуемый проект. - Отработка in vitro способов программирования «реверсного» М1 фенотипа макрофагов, обладающего способностью усиливать продукцию провоспалительных антиопухолевых цитокинов в ответ на действие антивоспалительных проопухолевых медиаторов; - Отработка способов введения репрограммированных макрофагов и оценка антиопухолевого эффекта на модели асцитной карциномы Эрлиха. 2) Формулировка цели реализуемого проекта. Разработка клеточной биотехнологии программирования фенотипа переключения у макрофагов для ограничения опухолевого роста.

Основные планируемые результаты проекта:
1) Краткое описание основных результатов (основные практические и экспериментальные результаты, фактические данные, обнаруженные взаимосвязи и закономерности).
•Завершены исследования по оценке роли NO в антиопухолевом действии макрофагов и формировании антиопухолевого М1 фенотипа. Проанализировано влияние асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ) на фенотип и секреторную NO-продуцирующую активность макрофагов и влияние асцитической жидкости и опухолевых клеток на фенотип и секреторную NO-продуцирующую активность макрофагов. Показано, что увеличение соотношения «опухолевые клетки/макрофаги» при АКЭ сопровождалось двух-кратным снижением концентрации нитритов в брюшной полости и угнетением способности макрофагов синтезировать NO, как в базальных условиях, так и в ответ на стимуляцию ЛПС. На терминальной стадии (11 день) АКЭ базальная продукция NO макрофагами снижалась в 3 раза, а стимулированная - в 4 раза, по сравнению с контролем. Низкая продукция NO является маркером проопухолевого М2 фенотипа макрофагов. Результаты, также показали, что и асцитическая жидкость и клетки АКЭ существенно угнетают NO-продуцирующую активность культивируемых макрофагов. Так под действием асцитической жидкости базальная продукция NO снижалась на 50%, а индуцированная - на 20%. При действии клеток АКЭ базальная продукция NO снижалась на 27%, а индуцированная - на 29%.
•Проведены исследования по оценке содержания про- и антивоспалительных цитокинов в асцитической жидкости на разных стадиях развития опухоли. Результаты показали, что перитонеальная среда контрольных мышей С57/BL6J имеет более выраженный провоспалительный сдвиг, по сравнению с мышами BALB/c. На lag-фазе развития АКЭ асцитическая жидкость мышей С57/BL6J имеет более выраженный провоспалительный статус, по сравнению с мышами BALB/c. При переходе с lag-фазы на log-фазу АКЭ происходит снижение содержания практически всех цитокинов, но при этом асцитическая жидкость мышей С57/BL6J сохраняет более выраженный провоспалительный статус, по сравнению с мышами BALB/c. При переходе с log-фазы АКЭ в терминальную происходит дальнейшее снижение провоспалительных цитокинов, но повышение большинства антивоспалительных цитокинов у обеих генетических линий, при этом межлинейные отличия между мышами С57/BL6J и BALB/c сохраняются и характеризуются тем, что асцитическая жидкость мышей С57/BL6J имеет более выраженный провоспалительный статус, по сравнению с мышами BALB/c.
•Проведены эксперименты по отработке процедуры формирования антиопухолевого фенотипа переключения у макрофагов. Установлено, что при действии асцитической жидкости на макрофаги М1 фенотипа происходило снижение продукции большинства провоспалительных цитокинов. Это снижение отражает репрограммирующее проопухолевое действие асцитической жидкости и репрограммирование макрофагов на проопухолевый М2 фенотип. При действии асцитической жидкости на М1 макрофаги с заблокированными факторами транскрипции М2 фенотипа, напротив происходило увеличение продукции большинства провоспалительных цитокинов. Это увеличение означает, в результате блокирования факторов транскрипции М2 фенотипа реакция М1 макрофагов на опухолевое окружение изменилась на противоположную, а именно в ответ на М2 репрограммирующую асцитическую жидкость макрофаги вместо снижения продукции провоспалительных антиопухолевых цитокинов стали отвечать усилением провоспалительных антиопухолевых цитокинов. Феномен переключения фенотипа при блокировании факторов транскрипции М2 фенотипа также проявляется и в отношении антивоспалительных цитокинов. При действии асцитической жидкости на макрофаги М1 фенотипа происходило увеличение продукции антивоспалительных цитокинов IL-5 и IL-10. Это увеличение согласуется с репрограммирующим проопухолевым действием асцитической жидкости и репрограммированием макрофагов на проопухолевый М2 фенотип. При действии асцитической жидкости на М1 макрофаги с заблокированными факторами транскрипции М2 фенотипа, происходило значительное снижение продукции всех антивоспалительных цитокинов.
•Разработан лабораторный технологический регламент репрограммирования макрофагов с целью получения антиопухолевого М3 фенотипа переключения у макрофагов. В проекте используется комбинированная модель с пониженными концентрациями сыворотки и добавлением IFN-γ и ингибиторов факторов транскрипции М2 фенотипа.
•Наработаны экспериментальные образцы репрограммированых макрофагов.
•Разработан план исследований экспериментальных образцов репрограммированых макрофагов антиопухолевого фенотипа переключения.
•Проведены эксперименты по отработке способов обратного введения репрограммированных макрофагов внутрибрюшинно.
•Проведены эксперименты по оценке воспалительных реакций у нормальных мышей без опухоли на введение репрограммированных макрофагов с фенотипом переключения. Результаты показали, что у мышей Balb/c введение макрофагов с фенотипом переключения не оказало достоверного влияния на локальный и системный воспалительный статус. У мышей C57/BL6J введение макрофагов с фенотипом переключения не оказало достоверного влияния на общий системный воспалительный статус, но привело к увеличению локального воспаления.
• Достигнуты индикаторы и показатели результативности проекта в 2015 году. Индикатор 1. Опубликованы 4 статьи в журнал, входящий в базу данных SCOPUS и Web of Science. 1. Калиш С.В., Буданова О.П., Лямина С.В., Малышев И.Ю. Генетические особенности систем генерации оксида азота предопределяют устойчивость организма к развитию карциномы. Патологическая физиология и экспериментальная терапия. – 2015, №1, с. 65-71. 2. Igor Malyshev and Yuri Malyshev, Current Concept and Update of the Macrophage Plasticity Concept: Intracellular Mechanisms of Reprogramming and M3 Macrophage “Switch” Phenotype, BioMed Research International Volume 2015 (2015), Article ID 341308, 1-22 pages; 3. Sergey V. Kalish, Svetlana V. Lyamina, Elena A. Usanova, Eugenia B. Manukhina, Nikolai P. Larionov, Igor Y. Malyshev. Macrophages Reprogrammed In Vitro Towards the M1 Phenotype and Activated with LPS Extend Lifespan of Mice with Ehrlich Ascites Carcinoma Med Sci Monit Basic Res, 2015; 21: 226-234; 4. Kalish S, Lyamina S, Chausova S, Kochetova L, Malyshev Y, Manukhina E, Malyshev I. C57BL/6N Mice Are More Resistant to Ehrlich Ascites Tumors Than C57BL/6J Mice: The Role of Macrophage Nitric Oxide. Med Sci Monit Basic Res. 2015 Oct 20;21:235-40. Таким образом индикатор 1 практически выполнен. Индикатор 3: Доля исследователей в возрасте до 39 лет в общей численности исследователей - участников проекта составила – 66,7%. Таким образом индикатор 3 выполнен полностью. Индикатор 4: Объем привлеченных внебюджетных средств составил 1,2 млн. руб. Из них 0.3 млн.руб от Индустриального партнера и 0.9 млн руб. от МГМСУ. Таким образом индикатор 4 выполнен полностью. Показатель 1: Средний возраст исследователей – участников проекта составил - 34,4, Таким образом Показатель 1 выполнен полностью. Показатель 2: «Количество мероприятий по демонстрации и популяризации результатов и достижений науки, в которых приняла участие и представила результаты проекта организация - исполнитель проекта, не менее» (конференции, семинары, симпозиумы, выставки и т.п., в том числе, международные). Исполнители приняли участие в 5-и мероприятиях по демонстрации и популяризации результатов и достижений науки, в которых приняла участие и представила результаты проекта организация - исполнитель проекта. Таким образом, показатель 2 выполнен полностью.

2) Основные характеристики результатов (в целом и/или отдельных элементов), научной (научно-технической, инновационной) продукции.
Результаты полученные в 2015 году при оценке роли NO в антиопухолевом действии макро-фагов и формировании антиопухолевого М1 фенотипа имеют следующие характеристики:
1. АКЭ сдвигает фенотип макрофагов мышей в сторону проопухолевого М2 фенотипа.
2. Снижение концентрации нитритов в асците при развитии АКЭ отражает снижение NO-продуцирующей активности М2 фенотипа макрофагов.
3. Растворимые в асците, мышей с опухолью, факторы и факторы, продуцируемые клетками АКЭ вносят вклад в репрограммирование макрофагов на М2 фенотип и снижение NO-продуцирующей активности макрофагов.
Результаты полученные при оценке содержания про- и антивоспалительных цитокинов в асците на разных стадиях развития опухоли имеют следующие характеристики. Полученные данные показали определённую стадийность в изменении содержания цитокинов в асцитической жидкости по мере развития АКЭ. Латентному периоду соответствует резкое увеличение продукции всех цитокинов, что может отражать активацию иммунитета и цитокин-продуцирующих клеток на появление опухолевых клеток. Увеличение продукции провоспалительных цитокинов и у C57/BL6J и у Balb/c свидетельствует об антиопухолевом характере активации иммунного ответа. Вместе с тем на латентной фазе также происходит существенное увеличение антивоспалительных цитокинов и у С57 и у Balb/c и цитокиновый баланс смешается в пользу антивоспалительных цитокинов. Многие антивоспалительные цитокины, и в частности те, содержание, которых существенно увеличивается на латентной стадии способны репрограммировать макрофаги на проопухолевый М2 фенотип. Поэтому можно предположить, что на латентной стадии происходят два параллельных процесса: 1. активация антиопухолевых функций иммунных клеток в форме усиления продукции провоспалительных антиопухолевых цитокинов и 2. создание условий для проопухолевой трансформации иммунных клеток, за счет увеличения продукции антивоспалительных проопухолевых цитокинов. При переходе АКЭ в стадию логарифмического роста (log-стадия) у обеих линий животных происходит резкое снижение содержания и провоспалительных и антивоспалительных цитокинов и у С57/BL6J и у Balb/c. Это снижение может отражать угнетающее действие опухолевых клеток и опухолевого микроокружения на активность иммунных клеток и антиопухолевого иммунитета. На этой стадии токсическое действие опухоли становиться очевидным: начинает накапливаться асцитическая жидкость. При переходе АКЭ в терминальную стадию, которая предшествует гибели животных, у обеих линий животных происходит дальнейшее снижение содержания провоспалительных цитокинов. Однако содержание многих антивоспалительных цитокинов увеличивается. Снижение продукции провоспалительных цитокинов и увеличение антивоспалительных очевидно отражает существенную трансформацию фенотипа иммунных клеток, и прежде всего макрофагов в проопухолевый М2 фенотип. На этой стадии токсическое действие опухоли становиться еще более очевидным: асцитическая жидкость накапливаться в большом количестве и животные погибают.
Определение содержания цитокинов на разных стадиях развития опухоли имеет важное значение для разработки технологии программирования у макрофагов фенотипа переключения. Данные показывают, что при развитии АКЭ среди проопухолевых антивоспалительных цитокинов, в асцитической жидкости и мышей C57BL/6 и BALB/c, наибольше увеличение происходит тех цитокинов, синтез которых контролируется факторами транскрипции М2 фенотипа. Это означает, что репрограммирование фенотипа переключения с целью дальнейшего использования для ограничения АКЭ надо проводить с использованием блокаторов факторов транскрипции М2 фенотипа.
Другой аспект состоит в том, что на всех стадиях развития АКЭ средний процент изменения M2 антивоспалительных цитокинов всегда выше такового для провоспалительных М1 цитокинов. Это также важно учитывать при использовании макрофагов с фенотипом переключения, а именно необходимо вводить макрофаги с фенотипом переключения на всех стадиях АКЭ.
Результаты полученные при отработке процедуры формирования реверсного антиопухолевого М1 фенотипа макрофагов с обратной связью характеризуются следующими положениями:
1. Реакции макрофагов с заблокированным факторами транскрипции М2 фенотипа на М2-репрограммирующую асцитическую жидкость меняется с угнетения на увеличение продукции провоспалительных цитокинов, что отражает формирование фенотипа переключения (М2/М1).
2. Реакции макрофагов с заблокированным факторами транскрипции М2 фенотипа на М2-репрограммирующую асцитическую жидкость меняется с увеличения некоторых на угнетение продукции всех антивоспалительных цитокинов, что подтверждает формирование фенотипа переключения (М2/М1).
3. Альтернативное изменение репрограммирования макрофагов с заблокированным факторами транскрипции М2 фенотипа на М2-репрограммирующую асцитическую жидкость с формирования М2 фенотипа на формирование М1 фенотип доказывает, что с помощью блокирования факторов транскрипции М2 фенотипа удалось сформировать у макрофагов фенотип переключения (М2/М1).
Результаты полученные при оценке воспаления у мышей после введения М1 макрофагов с фенотипом переключения показали отсутствие существенного влияния инъекции макрофагов с фенотипом переключения на системное воспаление как у мышей Balb/c, так и C57/BL6J. При оценке влияния инъекции макрофагов на локальное воспаление в перитонеальной полости выявились генетические отличия: у Balb/c изменения в общем воспалительном статусе были недостоверны, а у C57/BL6J локальное воспаление достоверно увеличилось. Эти отличия укладываются в хорошо известные представления о том, что C57/BL6J и Balb/c имеют существенные генетически обусловленные различия в развитии воспалительной реакции. Представленные данные подтвердили относительную безопасность макрофагов с фенотипом переключению для здорового организма. Это имеет важное значение для ПНИ в целом, поскольку использование разрабатываемой биотехнологии при опухолях должно быть безопасно для здоровья организма и не иметь побочных эффектов, в нашем случае системного воспаления.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
1. Описание конечного продукта, создаваемого с использованием результатов, планируемых при выполнении проекта, места и роли проекта и его результатов в решении задачи/проблемы. Конечным продуктом проекта является лабораторный прототип клеточной биотехнологии репрограммирования антиопухолевого фенотипа переключения у макрофагов. Роль проекта состоит в решении проблемы ограничения роста опухолевых клеток с помощью репрограммированных макрофагов.

2. Оценка элементов новизны научных (технологических) решений, применявших методик.
1. Мировые исследования, включая использование блокаторов факторов транскрипции, направлены либо на усиление формирования М1 фенотипа и его антиопухолевых свойств, либо на ослабление проопухолевых свойств М2 фенотипа макрофагов. Большая проблема в том, что опухоль рано или поздно за счет выделения репрограммирующих цитокинов, таких как TGF-β или IL-10 и др. перепрограммирует М1 фенотип в проопухолевый М2 фенотип. Мы впервые в мире предложили принципиально новый подход в использовании макрофагов для ограничения роста опухоли. Мы предложили программировать М3 фенотип переключения. М3 фенотип переключения, в отличие от всех других известных фенотипов в ответ на действие антиопухолевых проопухолевых цитокинов, выделяемых опухолью, отвечает продукцией провоспалительных антиопухолевых медиаторов. Это делает М3 фенотип переключения, в отличие от других фенотипов, практически неуязвимым к репрограммирующему действию опухоли.
2. Мы впервые теоретически обосновали и эксперементально проверили процедуру репрограммирования уникального М3 фенотипа. Представленные данные подтвердили нашу гипотезу о том, что с помощью комбинированной модели, сочетающей удаление FBS, добавление IFN-γ и ингибиторов факторов транскрипции, можно целенаправленно репрограммировать макрофаги на фенотип переключения. Впервые теоретически обоснована целесообразность разработки и использования комбинированной модели репрограммирования на М1 фенотип на стадии создания фенотипа переключения, с тем чтобы создать больше предпосылок для формирования фенотипа переключения, когда будут блокироваться факторы транскрипции М2-зависимых путей. Целесообразность введения ингибиторов факторов транскрипции М2 фенотипа связана с тем, что эти факторы транскрипции опосредует репрограммирующее на М2 фенотип многими цитокинами, которые выделяет опухоль, таких как IL-4, IL-10 и IL-13. Такое ингибирование приведет к тому, что сигналы от М2 цитокинов будут передаваться на пути М1 фенотипа, способствуя формированию фенотипа переключения М2/М1.
Впервые экспериментально проверена возможность репрограммирования макрофагов на фенотип переключения М2/М1. Проведенный анализ параметров фенотипа макрофагов: секреторная активность по оценке продукции NO, цитокинов, а также поверхностно-клеточные CD маркеры позволяет рассматривать нашу комбинированную модель, сочетающую удаление FBS, добавление IFN-γ и ингибиторов фаторов транскрипции М2 фенотипа при культивировании макрофагов, как хорошую модель репрограммирования макрофагов in vitro на провоспалительный фенотип переключения (М2/М1).
Таким образом, мы не только впервые, ввели понятие М3 фенотипа переключения макрофагов (Igor Malyshev and Yuri Malyshev, Current Concept and Update of the Macrophage Plasticity Concept: Intracellular Mechanisms of Reprogramming and M3 Macrophage “Switch” Phenotype, BioMed Research International Volume 2015 (2015), Article ID 341308, 22 pages), но и показали, как можно М3 фенотип программировать и как можно его использовать для ограничения опухолевого роста.
Представленные данные подтвердили нашу гипотезу о том, что с помощью комбинированной модели, сочетающей удаление FBS, добавление IFN-γ и ингибиторов факторов транскрипции, можно целенаправленно репрограммировать макрофаги на провоспалительный фенотип переключения.

3. Оценка получаемых результатов показала мировой уровень и потенциально высокую конкурентноспособность разрабатываемой в проекте технологии. Важная роль макрофагов в канцерогенезе предопределила колоссальный интерес к этим клеткам в качестве мишеней для ограничения опухолевого роста. В разных исследовательских центрах мира исследование возможности использования макрофагов для ограничения опухолевого роста проводятся в трех направлениях.
Первое направление. Программирование макрофагов на антиопухолевый М1 фенотип с помощью стимуляции Toll-like рецепторов и ингибирования рецепторов трансформирующего фактора роста (TGF-β) (Peng J, Tsang JY, Li D et. al. 2013), культивирования в среде без сыворотки (Rey-Giraud F, Hafner M, Ries CH. 2012) и усиления активности генов IFN-γ и IL-12 (Burke e.a. 2002, Andrews K et. al. 2000; Nasu Y et al. 1999; Satoh T, Saika T, Ebara S, Kusaka N, Timme TL, Yang G, Wang J, Mouraviev V, Cao G, Fattah el MA, Thompson TC. 2003). Второе направление. Связывание репрограммирующих проопухолевых факторов или их рецепторов на макрофагах (см. патент US patent 8,685,932, патентообладатель Option Pharmaceuticals, LLC (Vista, CA), PCT No.: PCT/US2009/067945; Date: August 23, 2011 PCT Pub. No.: WO2010/077831 PCT Pub. Date: July 08, 2010; Baay M, Brouwer A, Pauwels P, Peeters M, Lardon F. 2011; Sica A, Mantovani A. 2012). Третье направление. Угнетение проопухолевых свойств макрофагов с помощью антисенс олигонуклеотидов (Aharinejad S, et al. 2002), малых молекул (Gazzaniga S, Bravo AI, Guglielmotti A et al. 2007) и других подходов (Rolny C, Mazzone M, Tugues S. et al. 2011; Pàez-Ribes M, Allen E, Hudock J, Takeda T, Okuyama H, Viñals F, et al. 2009; Banciu M e.a. 2006).
По существу все три направления направлены на формирование и сохранение антиопухолевого М1 фенотипа. Репрограммирующее действие опухоли ограничивает антиопухолевый эффект М1 макрофагов. Мы впервые показали, что с помощью активации М1-репрограммирующих путей с одновременным блокированием факторов транскрипции М2 фенотипа можно программировать М3 фенотип переключения. М3 фенотип, в отличие от М1 фенотипа, на действие проопухолевых факторов (антивоспалительные цитокины, выделяемые опухолью), не только не перепрограммируется на проопухолевый М2 фенотип, но напротив, в опухолевом микроокружении еще больше продуцирует антиопухолевые провоспалительные цитокины. Мы показали, что М3 фенотип макрофагов, обладает прямым антиопухолевым антипролиферативным эффектом. Этот эффект М3 макрофагов был существенно больше, чем у М1 макрофагов и был сопоставим с эффектом противоопухолевого лекарства цисплатина. М3 макрофаги практически полностью подавили деление опухолевых клеток.

4. Пути и способы достижения заявленных результатов, ограничения и риски. Пути и способы достижения заявленных результатов относятся к методам молекулярной биологии, клеточной биотехнологии, биохимии и патофизиологии. Вся процедура применения репрограммированных макрофагов будет состоять из трех последовательных блоков: 1) Выделение макрофагов из перитонеальной жидкости мышей; 2) Культивирование и программирование макрофагов in vitro с целью задания нужного «терапевтического» М3 фенотипа переключения и 3) Введение репрограммированых in vitro макрофагов обратно внутрибрюшинно мышам с опухолью, с целью ограничения опухолевого роста и/или кокультивирование макрофагов с опухолевыми клетками с целью ограничение роста опухолевых клеток.
Ограничения и риски использования разрабатываемой биотехнологии определяются стандартными ограничениями и рисками переноса лабораторного прототипа в сферу клинического использования на людях.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
1. Описание областей применения планируемых результатов (области науки и техники, отрасли промышленности и социальной сферы, в которых могут использоваться результат или планируемая на их основе инновационная продукция).
Результаты могут быть использованы в области медицинских биотехнологий лечения рака и многих других заболеваний связанных с нарушением иммунного ответа, производстве репрограммирующих смесей, а также в образовательном процессе студентов медиков.

2. Описание практического внедрения планируемых результатов или перспектив их использования.
Разработка принципиально новых подходов в ограничении роста опухоли, несомненно имеет прикладную значимость для онкологической клиники. Прикладная значимость продукта определяется возможностью его производства и использования в здравоохранении. Разработка продукта с высокой прикладной значимостью имеет определенные последовательные этапы. Наш проект был одобрен как проект направленный на разработку лабораторного варианта биотехнологии ограничения опухолевого роста с помощью макрофагов. В ходе исследований показано, что репрограммированные макрофаги М1 фенотипа увеличивают продолжительность жизни мышей более, чем на 50%. Трансляция этого подхода в онкологическую клинику может показать высокую практическую значимость и эффективность по сравнению с методами химиотерапии. Кроме того, не исклбчено, что наша технология может повысить эффективность химиотерапии и снизить побочные эффекты химиотерапии. Мы ожидаем, что М3 фенотип переключения будет обладает еще более выраженным противоопухолевым эффектом.
Воспроизведение метода репрограммирования макрофагов в клинике реально, потому, что не требует уникального дорогостоящего оборудования и уникально-подготовленных специалистов. Уникален сам подход, но он может быть практически реализован в условиях обычной культуральной лаборатории.
Практическая значимость продукта безусловна определяется потенциальной востребованностью в здравоохранении. Если проект завершится успешно, новые подходы, которые могут эффективно ограничить опухолевый рост будут востребованы, особенно, если вспомнить какое место в структуре смертности занимают онкологические заболевания при всем разнообразии существующих методов терапии.
В крупных национальных фармацевтических и биотехнологических компаниях проходит от 5 лет когда компания может подтвердить или опровергнуть практическую значимость нового разрабатываемого продукта. Мы проводим исследования в течение 1 года. Использование нашей технологии в практике через 5 лет после обязательного прохождения всех этапов трансляции и внедрения, может показать, что практическая значимость нашей технологии является достаточно высокой.

3. Оценка или прогноз влияния планируемых результатов на развитие научно-технических и технологических направлений, разработку новых технических решений; на изменение структуры производства и потребления товаров и услуг в соответствующих секторах рынка и социальной сферы. Прогноз влияния планируемых результатов на развитие научно-технических и технологических направлений, разработку новых технических решений определяется тем, что результаты проекта покажут принципиальную возможность управления иммунным ответом, и нарушение иммунного ответа при развитии опухолей представляет только один из возможных случаев. Мы предполагаем, что наша биотехнология может оказаться эффективным инструментом коррекции нарушенного иммунного ответа не только при онкологических заболеваниях, но при других заболеваниях с нарушенным иммунным ответом: при сердечно-сосудистых, при легочных и других.

4. Оценка или прогноз влияния планируемых результатов на развитие исследований в рамках международного сотрудничества, развитие системы демонстрации и популяризации науки, обеспечение развития материально-технической и информационной инфраструктуры.
Результаты проекта были представлены на многих научных форумах как у нас в стране, так и за рубежом. Исполнители проекта имеют договор о научном сотрудничестве с университетом северного Техаса. В рамкам этого договора предполагается продолжение совместных исследований по теме проекта. Исполнители уже имеет опыт проведения совместных исследований с исследователями Университета Северного Техаса как в Москве, так и в США.
Развитие системы демонстрации и популяризации науки будет обеспечено, тем что в ходе проекта подготовлен сценарный план и видео сюжет о новой биотехнологии, который может быть использован для популяризации науки и результатов, полученных в проекте.

Текущие результаты проекта:
Макрофаги играют ключевую роль в нарушении иммунной системы при канцерогенезе. Важная роль макрофагов в канцерогенезе предопределила колоссальный интерес к этим клеткам в качестве мишеней для ограничения опухолевого роста.
Мы предположили, что проблему проопухолевой трансфомации иммунитета может решить особый М3 фенотип переключения. М3 фенотип в отличие от М1 фенотипа должен увеличивать продукцию антиопухолевых факторов в ответ на действие опухолевого микроокружения. М3 фенотип может дать макрофагу возможность не только увеличивать антиопухолевую активность в зоне опухоли, но самое главное избегать перепрограммирования на проопухолевый М2 фенотип. Цель текущих исследований состояла в проверке этой гипотезы. Задачами текущих исследований было 1) оценить эффект M3 макрофагов на рост опухолевых клеток и 2) оценить механизм антиопухолевого эффекта M3 макрофагов.

Текущие результаты проекта

1) M3 макрофаги продемонстрировали прямой антиопухолевый эффект, который не уступал эффекту противоопухолевого лекарства цисплатин и превосходил эффект М1 макрофагов.

Данные показали, что за 24 часа культивирования в среде содержащей 10% FBS, количество опухолевых клеток увеличилось в 7 раз. Добавление к опухолевым клеткам нерепрограмированных макрофагов (М0 фенотип) в соотношении macrophages : EAC cells 5:1 и 10:1, хоть и недостоверно, но замедлило рост клеток АКЭ. Однако начиная с соотношения 20:1 стала проглядывать интересная и важная тенденция. При соотношении 20:1 и 40:1 М0 фенотип, хоть и недостоверно, но стал увеличивать рост опухолевых клеток. При увеличении соотношения до 80:1 эта тенденция стала достоверной, рост EAC cells увеличился на 21%. Этот эффект отражает проопухолевую трансформацию макрофагов.
Добавление M1 или M3 макрофагов доза-зависимым образом ограничивало рост опухолевых клеток. При этом, антиопухолевый эффект не уступал эффекту противоопухолевого лекарства цисплатин и превосходил эффект М1 макрофагов.

2) Антиопухолевый эффект M3 макрофагов обусловлен анти-пролеферативным, а не цитотоксическим эффектом.

Количество мертвых опухолевых клеток при культивировании без и с макрофагами было незначительным и не превышало 5-7 процентов. В противоположность этому при культивировании с цисплатином количество мертвых опухолевых клеток могло достигать 25 процентов. Это означает, что антиопухолевый эффект M3 макрофагов обусловлен анти-пролеферативным, а не цитотоксическим эффектом, тогда как антиопухолевое действие цисплатина - как антипролеферативным, так и цитотоксическим. Количество мертвых макрофагов при культивировании без опухолевых клеток, при ко-культивирования с опухолевыми клетками, а также при культивировании с цисплатином достоверно не отличались между собой, было незначительными и не превышало 7-9 процентов.

Анализ влияния разных фенотипов макрофагов на рост опухолевых клеток выявил два интересных факта.
1. М0 фенотип при небольших соотношениях к опухолевым клеткам (5:1, 10:1) имеет тендецию к ограничению роста опухолевых клеток. Однако при увеличении соотношения М0 макрофагов к опухолевым клеткам М0 макрофаги начинают заметно стимулировать деление опухолевых клеток. Интересным оказалось, то, что в отсутствии опухолевых клеток маркер провоспалительного М1 фенотипа СD80, при увеличении количества М0 макрофагов в лунке не изменялся. Однако, когда к М0 макрофагам были добавлены опухолевые клетки, то при увеличении концентрации М0 макрофагов в лунке количество CD80 снижалось. Снижение содержания CD80 отражает сдвиг фенотипа макрофагов в сторону антивоспалительного М2 фенотипа, который обладает проопухолевыми свойствами. Эти данные, вероятно, могут дополнительно объяснить, хорошо известный в клинике феномен, что с увеличением концентрации макрофагов в зоне опухоли, прогноз исхода онкологического заболевания ухудшается.
2. В кривой доза-зависимости антиопухолевого эффекта и М1 и М3 макрофагов есть два участка: участок пропорционального подавления роста опухолевых клеток и участок относительного отсутствия доза-зависимости. Так, с увеличением соотношения М1 и М3 макрофагов к опухолевым клеткам с 5:1 до 20:1 происходит практически пропорциональное угнетение роста опухолевых клеток. Однако дальнейшее увеличение соотношения М1 и М3 макрофагов к опухолевым клеткам с 20:1 до 80:1 приводит лишь к очень незначительному дополнительному угнетению роста опухолевых клеток. Это позволяет нам выделить среди опухолевых клеток два разных пула: высокочувствительных и низкочувствительных к антипролефративному действию макрофагов. Деление высокочувствительного пула прекращается при увеличении соотношения макрофагов к опухолевым клеткам с 5:1 до 20:1. Дальше, несмотря на увеличение соотношения макрофагов к опухолевым клеткам с 20:1 до 80:1, опухолевые клетки низкочувствительного пула продолжают делиться. По нашим расчетам пул высокочувствительных к М1 макрофагам, опухолевых клеток составляет примерно 76%, а низкочувствительных - 24%. Пул высокочувствительных к М3 макрофагам, опухолевых клеток составляет 92%, а низкочувствительных - лишь 8%, т.е. в три раза меньше, чем доля опухолевых клеток низкочувстивительных к антипролеферативному действию М1 макрофагов.
Очевидно, что важным компонентом антиопухолевого эффекта М3 макрофагов по сравнению с М1 макрофагами, вероятно, является резистентность М3 фенотипа к репрограммирующему действию проопухолевых факторов и способность переключать сигнал от антивоспалительных цитокинов на продукцию провоспалительных цитокинов. Пока мы не можем точно сказать благодаря каким механизмам М3 макрофаги, по сравнению с М1 макрофагами, более эффективно ограничивали рост опухолевых клеток. Однако сам факт существенного подавления роста опухолевых клеток после добавления М3 макрофагов, свидетельствует о высокой перспективности разработки новых биотехнологий ограничения роста опухоли, с помощью in vitro репрограммированных М3 макрофагов.