Регистрация / Вход
Прислать материал

Создание биокатализатора на основе новой рекомбинантной синтазы цефалоспоринов-кислот для синтеза цефалоспориновых антибиотиков

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
антибиотики, цефалоспорины, биокатализаторы, гетерогенный катализ, геномика, ферменты, ферментативный синтез

Цель проекта:
Цель проекта состоит в создании научно-технического задела и предпосылок для разработки эффективных, экономичных и экологически-чистых биокаталитических технологий получения субстанций цефалоспориновых антибиотиков класса цефалоспоринов-кислот, широко востребованных на российском и зарубежном рынках, но в настоящее время не производимых отечественными предприятиями фармацевтической промышленности. Более конкретно, проект направлен на создание технологического гетерогенного биокатализатора на основе фермента, специфичного к синтезу цефалоспоринов-кислот (Cephalosporin-acid synthetase, CASA), продуцируемого оригинальным штаммом Escherichia coli CZ-08 и разработке метода биокаталитического синтеза цефалоспоринов-кислот.

Основные планируемые результаты проекта:
В результате реализации проекта должны быть получены следующие результаты:

1. Расшифрована нуклеотидная последовательность генома штамма E.coli CZ-08 –
продуцента CASA.
2. Идентифицирован ген CASA.
3. Выделен ген CASA и созданы конструкции для его экспрессии в клетках E.coli.
4. Создан гетерогенный технологический биокатализатор на основе рекомбинантной CASA.
5. Разработан метод биокаталитической трансформации соответствующих субстратов в цефазолин с использованием биокатализатора на основе рекомбинантной CASA.
При этом:
1. При расшифровке генома более 50% геномной последовательности должно быть представлено в виде непрерывных последовательностей ДНК (контигов) длиной не менее 100.000 нуклеотидов, соответствующих участкам генома.
2. Штамм продуцент рекомбинантной CASA должен обеспечивать высокий выход рекомбинантного фермента (не менее 5 % от суммарного белка клетки),
3. Биокатализатор (БК) на основе рекомбинатной CASA должен обеспечивать синтез цефазолина и других антибиотиков класса цефалоспоринов-кислот;
должен характеризоваться целевой синтетазной активностью – не менее 150 МЕ/г влажного БК, обладать периодом полуинактивации не менее 75 циклов.
4. Аналитический метод контроля процесса биокаталитического синтеза цефазолина должен осуществляться с использованием метода ВЭЖХ и обеспечивать детекцию таких компонентов реакционной смеси как бета-лактам-содержащий субстрат, ацилирующий агент, целевой продукт, побочный продукт.
Лабораторный метод биокаталитического синтеза цефазолина должен протекать в мягких условиях (температура не более 40ºС; рН 5÷8; среда водная или водная с содержанием этиленгликоля не более 45%); продолжительность процесса – не более 180 мин; выход целевого антибиотика (цефазолина) от бета-лактам-содержащего субстрата – не менее 80 %.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
В результате реализации проекта разработана технология биокаталитического синтеза бета-лактамного антибиотика цефазолина с использованием созданного в рамках проекта биокатализатора - иммобилизованного фермента CASA из рекомбинантного штамма E. coli ВКПМ В-12206.
Конечным продуктом разработанной технологии является цефазолин-содержащий раствор, предназначенный для выделения цефазолина и получения лекарственной субстанции, но созданный биокатализатор может быть использован и для получения других антибиотиков класса цефалоспоринов-кислот.
Цефалоспорины-кислоты относятся к бета-лактамным антибиотикам, которые занимают 65 % общего мирового рынка системных антибиотиков. В связи с отсутствием в России производства субстанций полусинтетических цефалоспоринов, имеется высокий рыночный потенциал технологий получения этих антибиотиков методами биокаталитической трансформации. Безусловными преимуществами процессов биокаталитического синтеза перед традиционными методами органического синтеза являются их относительная технологическая простота, исключение использования токсических реагентов и образования токсических отходов, а также низкая энергоемкость процессов за счет применения мягких условий проведения реакций и уменьшения объемов используемых растворителей, требующих регенерации.
Оригинальность проекта состоит в создании технологических биокатализаторов на основе внутриклеточной синтетазы цефалоспоринов-кислот, продуцируемой оригинальным рекомбинантным штаммом, созданным в ходе работ по проекту. Созданные в рамках проекта рекомбинантный штамм E. coli ВКПМ В-12206 и технологический биокатализатор на его основе по основным технологическим показателям близки к мировым аналогам или превосходят их. Разработанный биокатализатор обладает высокой эффективностью в процессе синтеза цефазолина и других цефалоспоринов-кислот.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Основная сфера применения результатов проекта - промышленная биотехнология, производство антибиотиков.
Результаты ПНИ могут быть использованы в дальнейших исследованиях и разработках:
Разработанная лабораторная технология биокаталитического синтеза цефазолина, а также проведенные исследования по составу получаемого цефазолин-содержащего раствора, могут использованы для создания технологии получения субстанции этого антибиотика.
Созданный технологический биокатализатор на основе CASA из рекомбинантного штамма E. coli ВКПМ В 12206 может быть использован для разработки методов биокаталитического синтеза других антибиотиков, принадлежащих к классу цефалоспоринов-кислот, а затем технологий получения субстанций этих антибиотиков.
Разработанные аналитические методы контроля процесса биокаталитического синтеза цефазолина, а также методы оценки технологических характеристик гетерогенного биокатализатора могут быть использованы при проведении исследований, направленных на создание биокаталитических технологий производства других β лактамных антибиотиков.
Разработанные подходы по идентификации гена CASA, его экспрессии, созданию биокатализаторов на его основе, могут быть использованы при создании других типов биокатализаторов для ферментативного синтеза других биологически-активных соединений для нужд пищевой, микробиологической и фармацевтической промышленности. Данные по расшифровки геномной последовательности штамма E.coli CZ-08 – продуцента CASA могут быть использованы в сравнительном геномном анализе. Результаты исследований могут быть востребованы при преподавании спецкурсов по промышленной микробиологии, медицинской биотехнологии.
Значителен потенциал использования результатов ПНИ в реальном секторе экономики:
Комплексные технологии производства субстанций цефалоспоринов-кислот, включающие стадии: получения биокатализатора на основе рекомбинантного штамма-продуцента CASA; получения ключевых бета-лактамных полупродуктов и ацилирующих агентов методами биосинтеза, биокатализа и химического синтеза; биокаталитического синтеза цефалоспориновых антибиотиков; выделения и очистки целевых продуктов могут быть реализованы на крупных отечественных предприятиях медицинской промышленности, например, ОАО «Биосинтез», Пенза; ОАО «Синтез», Курган.
Производство гетерогенных технологических биокатализаторов для процессов синтеза цефалоспоринов-кислот в опытно-промышленном масштабе может быть организовано на малых предприятиях, обладающих ферментационными мощностями. В этом случае рынком сбыта продукции (гетерогенных биокатализаторов) могут служить как отечественные, так и зарубежные предприятия, производящие цефалоспорины-кислоты биокаталитическим способом.
Возможна реализация лицензий на разрабатываемые технологии, как в России, так и за рубежом.
Итак, можно с уверенностью заключить, что проект позволит разработать эффективные технологии биокаталитического синтеза антибиотиков класса цефалоспоринов-кислот при одновременном сокращении энергозатрат, трудоемкости технологических операций и пр.,
снижения экологической нагрузки при производстве. Разработанные технологии могут позволить повысить рентабельность
производства отечественных антибиотических субстанций, внедрить их в обозримом будущем на отечественных
предприятиях фармацевтической промышленности, простимулировать производство готовых лекарственных форм, снизить
зависимость отечественного лекарственного рынка от импортных субстанций и препаратов.

Текущие результаты проекта:
Методом высокопроизводительного пиросеквенирования расшифрован геном штамма E.coli CZ-08. Показано, что геном кодирует 4820 открытых рамок считывания для белков, средний размер ОРС составляет 899 пн. Для 3907 белков удалось предсказать функцию, в то время как 913 потенциальных белков являются «гипотетическими. При анализе генома выявлены множественные полиморфизмы и
различия в наборах кодируемых генов по сравнению с геномом родительского штамма. Методами биоинформатики ген CASA
идентифицирован как прямой гомолог гена пенициллин G ацилазы. Вывод подтвержден результатами клонирования гена, его
экспрессии, определения ферментативной активности в реакции синтеза цефазолина. Ген CASA выделен, клонирован в
оригинальный вектор экспрессии, получен эффективный штамм-продуцент CASA.
За счет подбора параметров культивирования штамма и вариантов конструкций вектора достигнут высокий уровень
продукции CASA в клетках E.coli. Разработан высокоэффективный метод получения гетерогенного биокатализатора на
основе рекомбинантной CASA для процессов ферментативного синтеза цефазолина.
Разработана аналитическая методика контроля процесса биокаталитического синтеза цефазолина, позволяющая проводить
операционные испытания технологического биокатализатора на основе CASA с целью определения таких технологических
характеристик как максимальная степень превращения бета-лактам-содержащего субстрата в цефазолин и период
полуинактивации биокатализатора, а также осуществлять динамический контроль процесса синтеза для исследовательских
целей. Разработан проект ТУ на технологический биокатализатор на основе рекомбинантной CASA.
Полученный рекомбинантный штамм E. coli– продуцент CASA обеспечивает высокий уровень продукции целевого фермента
(35-40 МЕ/мл культуры), что в 2-3 раза превосходит известные аналоги.
Ферментативная активность полученных образцов биокатализаторов находится в диапазоне 185-280 МЕ/г влажного
биокатализатора, содержание сухих веществ - 31-33%, период полуинактивации составляет 140-210 циклов.
На основании обзора информационных источников сделан вывод, что проведенные работы обладают несомненной новизной и
соответствуют мировому научно-техническому уровню. Проведенные патентные исследования показали, что штамм E. coli
ВКПМ В-12206 – продуцент CASA и технологический биокатализатор на его основе по основным технологическим
показателям близки к мировым аналогам или превосходят их.
Разработан «Лабораторный технологический регламент процесса биокаталитического синтеза цефазолина» с учетом требований ОСТ 64-02-003-2002. Разработанный биокатализатор обладает высокой эффективностью в процессе синтеза цефазолина и других цефалоспоринов-кислот. Разработанный метод синтеза позволяет осуществлять биокаталитическую трансформацию β-лактам-содержащего субстрата в цефазолин с выходом 80-90 %, а в специальных условиях – до 95 %.