Регистрация / Вход
Прислать материал

Интеграция новейших достижений геномики и метагеномики в технологию производства микробных препаратов

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
сельскохозяйственная биотехнология, пиросеквенирование коммерческих штаммов, методы экспресс-контроля качества микробных препаратов, безопасное использование биопрепаратов

Цель проекта:
Формулировка задачи проекта: Осуществление эффективного контроля качества производимых микробных препаратов с целью обеспечения их безопасного использования в агропромышленном комплексе РФ. Формулировка цели проекта: Разработка с использованием высокопроизводительного секвенирования оперативных технологических решений для повышения контроля качества микробных биопрепаратов.

Основные планируемые результаты проекта:
Краткое описание основных результатов:
1. Разработка мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК (референт-комплекса) для достоверной таксономической и функциональной аутентификации коммерческих штаммов сельскохозяйственных микроорганизмов.
2. Разработка молекулярного диагностикума, позволяющего детектировать у коммерческих штаммов мутационную изменчивость и крупномасштабные геномные перестройки.
3. Разработка эффективных методов контроля микробиологической чистоты биопрепаратов на всех стадиях производственного цикла.

Основные характеристики планируемых результатов:
Предлагаемые к выполнению ПНИ позволят стандартизировать биотехнологические производства биопрепаратов энтомоцидного и родентицидного действия для повышения эффективности контроля над микробным материалом и гарантии высокого качества и экологической безопасности выпускаемой продукции. Проводимые исследования по геномному пиросеквенированию генетических ресурсов
сельскохозяйственных микроорганизмов, сконцентрированных в ВКСМ, обеспечат принципиальные преимущества по сравнению с существующими методами контроля качества производственных штаммов и будут способствовать усилению конкурентных позиций отечественных сельхозпроизводителей по параметрам эффективного использования микробных биопрепаратов, а также уменьшения риска применения в открытых экосистемах патогенных микроорганизмов.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
Описание конечного продукта:
Технология оперативного контроля качества микробных биопрепаратов на базе высокопроизводительного секвенирования.

Оценка элементов новизны научных решений:
Для осуществления контроля за качеством микробного материала необходима детальная молекулярно-генетическая характеристика (паспортизация) микроорганизмов. Наиболее надежным методом паспортизации, предоставляющим исчерпывающую информацию о штамме, является полногеномное секвенирование на базе высокопроизводительных платформ. Однако, использование высокопроизводительного секвенирования в интересах заинтересованных научных и коммерческих организаций ограничивается значительной трудозатратностью и себестоимостью анализа (порядка 200000 рублей за 1 штамм). Поэтому для практического привлечения таких высокотехнологичных работ, конечной целью которых является экологическая и продовольственная безопасность сельскохозяйственных биотехнологий, необходима разработка экспресс-методов, позволяющих проводить доступный и оперативный контроль за качеством микробного материала
на всех этапах производственного процесса.

Сопоставление с результатами аналогичных работ, определяющими мировой уровень:
Наличие большого количества патентных документов, как в России так и за рубежом, подтверждает перспективность и актуальность разработки метода мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК для достоверной аутентификации микроорганизмов. Ведущими странами в этой области разработок являются: Россия, США. Проведенные исследования показали целесообразность патентования разрабатываемого метода мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК для достоверной аутентификации микроорганизмов.

Пути и способы достижения заявленных результатов, ограничения и риски:
1. Отбор 20 коммерческих штаммов Bacillus thuringiensis и Salmonella enteritidis var. Issatschenko, являющихся основой биопрепаратов битоксибациллин, бацикол и бактороденцид.
2. Проведение геномного пиросеквенирования отобранных коммерческих штаммов с различным спектром энтомоцидной и родентицидной активности.
3. Проведение анализа полногеномных сиквенсов с целью локализации таксономически- и функционально-значимых генетических локусов: генов рибосомных РНК и локусов «домашнего хозяйства», а также генов вирулентности.
4. Выбор референт-комплекса – последовательностей ДНК, отражающий уникальные генетические характеристики штаммов и достаточный для их достоверной таксономической и функциональной аутентификации.
5. Разработка мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК (референт-комплекса) на основе метода высокопроизводительного секвенирования ампликонных библиотек.
6. Разработка молекулярного диагностикума, позволяющего детектировать мутационную изменчивость и крупномасштабные геномные перестройки у коммерческих штаммов на основе результатов геномного AFLP фингерпринтинга и пульс-электрофореза.
7. Разработка методики контроля микробиологической чистоты биопрепаратов на всех стадиях производственного цикла.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Описание областей применения планируемых результатов:
Сельскохозяйственные биотехнологии.

Перспективы использования результатов:
1. Проведение с помощью мультиплексного экспресс-анализа, разработанного на базе высокопроизводительного пиросеквенирования, таксономической и функциональной аутентификации коммерческих штаммов, использующихся в производстве инсектицидных и родентицидных биопрепаратов.
2. Детекция мутационной изменчивости и крупномасштабных геномных перестроек, влияющих на эффективность коммерческих штаммов с помощью разработанных молекулярных диагностикумов.
3. Проведение эффективного контроля микробиологической чистоты биопрепаратов на всех стадиях производственного цикла.
4. Стандартизация биотехнологических производств для обеспечения эффективного использования микробных биопрепаратов, а также уменьшения риска применения патогенных микроорганизмов в открытых экосистемах.
5. Разработка методов контроля качества широкого спектра коммерческих штаммов, использующихся при производстве микробных препаратов на основе экстраполяция полученных результатов.

Оценка или прогноз влияния планируемых результатов на развитие научно-технических и технологических направлений, разработку новых технических решений; на изменение структуры производства и потребления товаров и услуг в соответствующих секторах рынка и социальной сферы:
Выполнение ПНИ будет способствовать:
1. Усилению конкурентных позиций отечественных сельхозпроизводителей по параметрам эффективного использования микробных биопрепаратов, а также уменьшения риска применения в открытых экосистемах патогенных микроорганизмов.
2. Повышению уровня продовольственной безопасности в РФ.

Оценка или прогноз влияния планируемых результатов на развитие исследований в рамках международного сотрудничества, развитие системы демонстрации и популяризации науки, обеспечение развития материально-технической и информационной инфраструктуры:
Выполнение ПНИ будет способствовать достижению прорывных результатов в области интеграции новейших достижений геномики и
метагеномики в технологию производства микробных препаратов и расширению международного сотрудничества по проблеме биобезопасности и стандартизации микробных технологий на уровне как научных, так и коммерческих организаций.

Текущие результаты проекта:
1. Отобраны 20 коммерческих штаммов Bacillus thuringiensis и Salmonella enteritidis vr. Issatschenko, являющихся основой биопрепаратов битоксибациллин, бацикол и бактороденцид. Отобран штамм Bacillus thuringiensis №25, обладающий наивысшими показателями энтомоцидной активности.
2. В результате испытания разных источников азотного питания, а также изучения влияния дозы, формы, возраста и аэрации посевного материала на продуктивность штамма Bacillus thuringiensis №25 оптимизирован режим его культивирования для повышения эффективности энтомоцидного биопрепарата.
3. Оптимизирован протокол выделения бактериальной ДНК, которое является одним из наиболее важных этапов полногеномного секвенирования.
4. Получены 20 полногеномных сиквенсов штаммов Bacillus thuringiensis и Salmonella enteritidis vr. Issatschenko и начата работа по их сборке для последующего выявления наиболее дивергентных генетических локусов и разработки метода мультиплексного экспресс-анализа ДНК для достоверной аутентификации микроорганизмов.
5. В результате сравнительного анализа полногеномных последовательностей штаммов B. thuringiensis разных серотипов выявлены уникальные гены «домашнего хозяйства» и вирулентности.
6. Получен референт-комплекс генов "домашнего хозяйства" и вирулентности для выборочного мультиплексного пиросеквенирования на основе последовательностей ранее отобранных локусов (glpT, pyrE, purF, purH, pta, gyrB, ftsA, panC, isd, nheA, nheC, capA, capC и inA) с добавлением 9 дополнительных генов: ywfK, adk, clpC, dinB, rpoB, tpi, mutS, ilvD и mdh.
7. Разработан протокол проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК.
8. Разработан паспорт, отражающий генетические особенности изученного коммерческого штамма B. thuringiensis var. thuringiensis №25, обладающего высокой технологичностью и наилучшими показателями активности.
9. Разработан молекулярный диагностикум, позволяющий детектировать мутационную изменчивость и крупномасштабные геномные перестройки у коммерческих штаммов на основе результатов геномного AFLP фингерпринтинга и пульс-электрофореза.
10. Разработана методика контроля микробиологической чистоты биопрепаратов на всех стадиях производственного цикла.
11. Проведена валидация разработанной методики.
12. С целью гарантийного хранения и патентной процедуры в коллекции ВКСМ депонировано 250 практически-ценных штамма сельскохозяйственных микроорганизмов, принадлежащих сторонним организациям.