Регистрация / Вход
Прислать материал

Создание нового эффективного инструментария на основе промоторных областей генов антимикробных пептидов proSmAMP1 и proSmAMP2 из сорного растения мокрицы (Stellaria media) для генетической инженерии двудольных сельскохозяйственных культур

Номер контракта: 14.604.21.0028

Руководитель: Бабаков Алексей Владимирович

Должность руководителя: зав.лабораторией

Докладчик: Комахин Роман Александрович, зав.лабораторией

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
промоторы генов, гены антимикробных пептидов, трансгенные растения, генетическая инженерия, генетические конструкции, экспрессия генов, мокрица stellaria media

Цель проекта:
1. Целью проекта является создание наборов новых эффективных промоторов для генетической инженерии двудольных растений на основе промоторных областей генов pro-SmAMP1 и pro-SmAMP2 из сорного растения мокрицы (Stellaria media) для получения цисгенных сельскохозяйственных растений с повышенной устойчивостью к неблагоприятным факторам окружающей среды. 2. Создание новых генетических конструкций с использованием промоторных областей генов антимикробных пептидов pro-SmAMP1 и pro-SmAMP2 из сорного растения мокрицы (Stellaria media) для генетической инженерии двудольных сельскохозяйственных культур.

Основные планируемые результаты проекта:
1. Объектом исследования являются различные трансгенные или агророинфильтрированные растения табака, свеклы, рапса и Nicotiana benthamiana, трансформированные генетическими конструкциями с репортерным геном gus под контролем различных делеционных вариантов промоторной области генов pro-SmAMP1 и pro-SmAMP2 из сорного растения мокрица Stellaria media.
1.1 Установлено, что высокая активность делеционных вариантов -2160 и -495 п.н. промотора proSmAMP2 сохранилась в трех последовательных поколениях трансгенных растений табака. Оба делеционных варианта промотора pro-SmAMP2 во всех поколениях трансгенных растений табака были существенно более эффективными, чем вирусный промотор CaMV35S. Для модификации растений предпочтительнее использовать генетические конструкции с делеционным вариантом -495 п.н. промотора pro-SmAMP2, показавшим наиболее высокий и стабильный результат при меньших размерах его нуклеотидной последовательности. В трансгенных растениях табака двух поколений все пять делеционных варианта промотора pro-SmAMP1 были более эффективными, чем вирусный промотор CaMV35S. Все изученные делеционные варианты промотора pro-SmAMP1 были активны примерно на одном уровне. В трансгенных растениях табака существовала положительная корреляция между высоким уровнем активности репортерного фермента GUS и уровнем экспрессии кодирующего его гена, находящегося под контролем делеционных вариантов промотора pro-SmAMP1. Следовательно, промотор растительного гена pro-SmAMP1 сохраняет транскрипционные свойства в ряду поколений трансгенных растений на высоком уровне. Все делеционные варианты промотора pro-SmAMP1 активны во всех изученных органах (корни, стебли, листья, бутоны, пыльники) трансгенных растений табака на спорофитной и на гаметофитной (пыльца) стадиях развития. Уровень активности делеционных вариантов pro-SmAMP1 различен в разных органах трансгенных растений. Наиболее конститутивным был делеционный вариант -481 п.н. pro-SmAMP1, а наиболее органоспецифичен делеционный вариант -1200 п.н.
1.2 В агроинфильтрированных растениях N. benthamiana все делеционные варианты промотора гена pro-SmAMP1 из мокрицы были существенно более эффективными, чем вирусный промотор CaMV35S. Применение делеционных вариантов промотора proSmAMP1 для биотехнологии растений приоритетно с точки зрения экологической безопасности, поскольку они могут заменить в генетических конструкциях для трансформации растений промоторы вирусов, бактерий или животных. В целом уровень активности GUS в агроинфильтрированных растениях рапса был относительно низким, в сравнении с агроинфильтрированными растениями Nicotiana benthamiana, но выше, чем в растениях свеклы. В некоторых агроинфильтрированных растениях рапса или листьях свеклы эффективность делеционных вариантов -862 п.н. и -495 п.н. промотора pro-SmAMP2 была выше, чем вирусного промотора CaMV35S, или не уступала ему.

2. Делеционные варианты промоторов pro-SmAMP1 и pro-SmAMP2 могут быть использованы для экспрессии целевых генов в поколениях трансгенных растений, содержащих инсерции Т-ДНК в качестве аллелей. Делеционные варианты промотора pro-SmAMP1 и pro-SmAMP2 могут быть использованы для создания цисгенных растений. Делеционные варианты -862 п.н. и -495 п.н. промотора pro-SmAMP2 могут быть использованы для генетической модификации растений ярового рапса и сахарной свеклы с целью получения цисгенных растений.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
1. Наборы делеционных вариантов промоторов генов pro-SmAMP1 и pro-SmAMP2 в составе плазмиды pGEM-T и генетические конструкции для трансформации растений, содержащие промоторы генов pro-SmAMP1 и pro-SmAMP2, на основе плазмиды pCambia 2301 могут быть использованы для создания цисгенных сельскохозяйственных растений.

2. Новизна научного решения обусловлена использованием уникальных нуклеотидных последовательностей промоторов генов антимикробных пептидов pro-SmAMP1 и pro-SmAMP2 из растения S. media.

3. Результаты проекта сопоставимы с мировым уровнем исследований и позволят разработать новые технические решения в области генетической инженерии и биотехнологии двудольных растений.

4. Необходимо сравнительное изучение эффективности промоторов pro-SmAMP1 и pro-SmAMP2 в линиях различных трансгенных сельскохозяйственных растений (рапс, сахарная свекла и др.). Ограничения могут быть обусловлены отсутствием некоторых факторов транскрипции, необходимых для эффективной работы промоторов в различных видах сельскохозяйственных растений.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
1. Научно-исследовательские учреждения и ВУЗы России смогут использовать результаты проекта для проведения фундаментальных и прикладных исследований в области биологии растительной клетки (Геномные, протеомные и постгеномные технологии; Технологии биоинженерии). Инновационные биотехнологические компании смогут использовать результаты проекта для биосинтеза в растениях рекомбинантных белков медицинского и ветеринарного назначения (Биомедицинские и ветеринарные технологии). Инновационные агрохимические предприятия, научно-исследовательские учреждения и селекционные центры страны смогут использовать результаты проекта для получения сельскохозяйственных цисгенных растений, устойчивых к стрессам или с улучшенным качеством продукции. Результаты работы окажут существенное позитивное влияние на решение задач развития ТП «Биоиндустрия и Биоресурсы – Биотех2030» в области сельскохозяйственной биотехнологии.

2. Результаты исследований будут защищены с использованием отечественных патентов, представлены на отечественных и международных научных конференциях в виде докладов и опубликованы в специализированной научной литературе, в том числе в научных журналах, индексируемых в базе данных Scopus или в базе данных "Сеть науки" (WEB of Science). Защищенные патентами результаты исследований будут преданы индустриальному партнеру для коммерциализации (продажа заинтересованным компаниям). Также совместно Исполнителем и Индустриальным партнером с использованием нового генетического инструментария будут созданы цисгенные линии сельскохозяйственных растений с новыми агрономически-важными признаками которые на основании лицензионных договоров будут передаваться селекционным или семеноводческим предприятиям.

3. Результаты исследований позволят в работах по биотехнологии растений заменить вирусные промоторы в генетических конструкциях для трансформации двудольных растений на экологически более безопасные и эффективные промоторы генов растений.

4. Наборы делеционных вариантов промоторов генов pro-SmAMP1 и pro-SmAMP2 могут быть использованы для проведения международных исследований, поддержанных совместными грантами.

Текущие результаты проекта:
Был осуществлен дизайн праймеров для амплификации и клонирования делеционных вариантов -1200, -700, -650, -603, -481 п.н. промоторной области гена pro-SmAMP1 и делеционных вариантов -2160, -862, -495 п.н. промоторной области гена pro-SmAMP2. С их использованием были амплифицированы все выше перечисленные варианты промоторов и клонированы в плазмиду pGEM-T. С помощью секвенирования были отобраны плазмиды pGEM-T с заданными нуклеотидными последовательностями каждого делеционного варианта промотора. Затем с их использованием были получены генетические конструкции для трансформации двудольных растений на основе плазмиды pCAMBIA-2301. Их корректность сборки была проверена секвенированием.