Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка кандидатного лекарственного средства на основе противоопухолевого белка лактаптина и онколитического вируса осповакцины

Номер контракта: 14.604.21.0057

Руководитель: Рихтер Владимир Александрович

Должность: заместитель директора

Организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук
Организация докладчика: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
лактаптин, вирус осповакцины, онколитические вирусы, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, опухоль молочной железы, апоптоз, рекомбинантный вирус, ген тимидинкиназы, ген вирусного ростового фактора, противораковая терапия, иммунодефицитные мыши

Цель проекта:
В XX-XXI веке рост числа онкологических заболеваний происходил такими быстрыми темпами, что дало основание для сравнения его с эпидемией. Ежегодная смертность от злокачественных новообразований в нашей стране составляет около 180 случаев у мужчин и 95 случаев у женщин на 100 тысяч населения. По прогнозам ВОЗ смертность от рака будет продолжать расти, и в 2030 году ожидается до 13 миллионов случаев смерти от онкологических заболеваний. Многие годы основными способами лечения онкологических заболеваний были хирургия и радиотерапия, направленные на удаление первичной опухоли. Применение "неспецифических" цитостатических и цитотоксических средств, а также гормонов для подавления роста метастазов существенно расширило возможности и повысило эффективность лечения рака. Однако, высокая общая токсичность большинства используемых противоопухолевых средств значительно ограничивает возможности их применения. Таким образом, на сегодня лимитирующими требованиями при создании противораковых препаратов являются минимальная токсичность по отношению к здоровым клеткам организма и максимальная эффективность по отношению к онкотрансформированным клеткам. Подобная селективность может быть обеспечена применением лекарственных средств, индуцирующих процессы апоптоза и аутофагии в клетках опухоли. Поэтому создание противоопухолевых лекарств на основе природных белков и пептидов, способных вызывать апоптотическую гибель раковых клеток и не повреждающих при этом здоровые клетки, является актуальным и активно развивающимся направлением. Также одним из активно развивающихся направлений исследований при создании противоопухолевых лекарственных средств является использование способности онколитических вирусов избирательно уничтожать опухолевые клетки, не оказывая значительного токсического воздействия на нормальные клетки организма. Подобное специфическое разрушение злокачественных клеток может происходить напрямую за счет преимущественной репликации вируса в этих клетках, или же оно может быть опосредовано иммунной системой, простимулированной вирусом. Настоящий проект направлен на создание кандидатного противоопухолевого лекарственного средства на основе рекомбинантного штамма вируса осповакцины с двойной делецией генов тимидинкиназы и ростового фактора и встройкой в делетированные участки генома двух трансгенов – апоптоз-индуцирующего белка лактаптина (фрагмента каппа казеина человека) и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) человека. Цель проекта: Разработать кандидатное лекарственное средство с направленной иммуностимулирующей и апоптоз-индуцирующей противоопухолевой активностью на основе рекомбинантного штамма вируса осповакцины, содержащего двойную встройку генов гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) человека и противоопухолевого белка лактаптина.

Основные планируемые результаты проекта:
В ходе выполнения ПНИ будут получены следующие результаты:
Разработанные методики:
1. Методика конструирования и очистки инсерционной плазмиды для встройки гена лактаптина в район гена ростового фактора вируса осповакцины, штамм Л-ИВП.
2. Методика получения рекомбинантных штаммов вируса осповакцины (штамм Л-ИВП) методом временной доминантной селекции.

Экспериментальные результаты:
1. Инсерционные плазмиды для встройки гена лактаптина в район гена ростового фактора вируса осповакцины штамма Л-ИВП.
2. Экспериментальные образцы рекомбинантных штаммов вируса осповакцины, продуцирующего ГМ-КСФ и лактаптин (далее - экспериментальные образцы рекомбинантных штаммов).

Разработанные документы:
1. Промежуточные и заключительный отчеты о ПНИ
2. Отчет о патентных исследованиях и Отчеты о дополнительных патентных исследованиях,
3. Лабораторный регламент наработки и очистки рекомбинантных штаммов вируса осповакцины, продуцирующего ГМ-КСФ и лактаптин.
4. Программа и методики исследовательских испытаний экспериментальных образцов рекомбинантных штаммов и протоколы исследовательских испытаний
5. Рекомендации и предложения по использованию результатов поисковой ПНИ в реальном секторе экономики, а также в дальнейших исследованиях и разработках
6. Технико-экономическое обоснование разработки продукции с учетом технологических возможностей и особенностей индустриального партнера.
7. Проект технического задания на проведение ОТР по теме: «Создание опытно-промышленной технологии получения противоопухолевой субстанции на основе рекомбинантного штамма вируса осповакцины, продуцирующего ГМ-КСФ и лактаптин».

2. Характеристики разработанных методик:
Разработанные в ходе выполнения ПНИ методики получения рекомбинантных штаммы вируса осповакцины должны обеспечить:
- масштабирование в лабораторном и промышленном производстве;
- перенос технологических процессов для получения аналогичных препаратов.

Характеристики экспериментальных результатов:
1. Инсерционные плазмиды должны обеспечивать встройку гена лактаптина в район гена ростового фактора вируса осповакцины, штамм Л-ИВП. Наработка и очистка плазмидных ДНК должна быть проведена в условиях эндотоксин-фри. Выход очищенных плазмидных ДНК должен составлять не менее 50 мкг каждой.
2. Рекомбинантные штаммы вируса осповакцины должны:
- содержать две встройки генетического материала: первая - полноразмерная ДНК копия (кДНК) матричной РНК гранулоцитарно-макрофагального колониестиму-лирующего фактора человека (ГМ-КСФ) размером 850 п.н. (GenBank, Accession M11220.1); вторая – ген лактаптина. Оба гена должны экспрессироваться под контролем ранне-поздних промоторов вируса осповакцины. Ген ГМ-КСФ дол-жен быть встроен в район частичной делеции гена вирусной тимидинкиназы (ТК, J2R), а ген лактаптина – в район частичной делеции гена вирусного ростового фактора (VGF, C11R);
- сохранять генетическую структуру и экспрессировать встроенные гены ГМ-КСФ и лактаптина не менее чем в течение 20 пассажей на культуре клеток.
3. Экспериментальные образцы рекомбинантных штаммов должны быть получены в количестве не менее 2 и отвечать следующим требованиям:
- инфекционность не ниже 1х107 БОЕ/мл, где БОЕ – количество бляшкообразую-щих единиц, образованных вирусом на монослое клеток почки африканской зе-леной мартышки CV-1;
- аттенуация (ослабление вирулентности) не менее чем в 10 раз по сравнению с исходным штаммом Л-ИВП. Аттенуация должна быть измерена по величине 50%-ной летальной дозы (ЛД50) вирусов, исходного и рекомбинантного, для 10-дневных куриных эмбрионов;
- отсутствие острой токсичности и реактогенности при подкожном введении белым беспородным мышам в дозе не ниже 1х107 БОЕ/мышь
- вызывать 50%-ный литический эффект при дозе заражения не более чем 0,1 БОЕ/клетка в отношении не менее, чем одного вида раковых клеток человека.
- обеспечивать не менее 50% выживания животных с алло- или ксенотрансплантатами опухолей при интратуморальном введении в дозе 1х107 БОЕ/мышь.

Характеристики разрабатываемых документов:
1. Оформление технической документации должно соответствовать требованиям ГОСТ 2.125-2008.
2. Состав отчетной документации, подлежащей оформлению и сдаче Получателем субсидии Минобрнауки России на этапах выполнения работ, определяется нормативными актами Минобрнауки России.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
1. Конечным продуктом, создаваемым с использованием результатов, планируемых при выполнении проекта, будет являться кандидатное лекарственное средство с иммуностимулирующей (за счет ГМ-КСФ) и апоптоз-индуцирующей (за счет лактаптина) противоопухолевой активностью. Будет проведено сравнительное исследование несекретируемой и секретируемой форм лактаптина в составе рекомбинантного вируса. Секреция апоптоз-индуцирующего белка может обеспечить дополнительное цитотоксическое действие на клетки, соседствующие с инфицированными рекомбинантным вирусом клетками внутри опухоли, за счет передачи лактаптина через межклеточное пространство.

2. В настоящем проекте для усиления противоопухолевого эффекта лактаптина впервые использован вирус осповакцины, который и сам обладает природными онколитическими свойствами. Впервые для конструирования рекомбинантного онколитического вируса используется комбинация генов иммуностимулирующего белка (ГМ-КСФ) и апоптоз-индуцирующего белка (лактаптин). Совместное введение в геном вируса генов апоптоз-индуцирующего белка и ГМ-КСФ будет приводить к усилению лизиса раковых клеток, одновременному высвобождению большого количества слабо иммуногенных опухолеассоциированных антигенов и презентации их иммунной системе организма. Такой подход создания противоопухолевых препаратов используется впервые.
Авторы проекта также сконструировали секретируемый вариант лактаптина в составе двойного рекомбинантного вируса осповакцины. Секреция апоптоз-индуцирующего белка может обеспечить дополнительное цитотоксическое действие на клетки, соседствующие с инфицированными рекомбинантным вирусом клетками, внутри опухоли за счет передачи лактаптина через межклеточное пространство. Этот эффект, известный как эффект свидетеля (bystander effect), ранее был показан для гена тимидинкиназы вируса простого герпеса HSVtk (Алексеенко И.В. и др., (2011) Доклады Академии наук).
Таким образом, в результате выполнения проекта будут получены результаты, способные к правовой охране, а именно: рекомбинантные штаммы вируса осповакцины с встроенными генами лактаптина и ГМ-КСФ, обеспечивающие продукцию секретируемого и несекретируемого варианта белка.

3. В настоящее время создание противоопухолевых препаратов на основе природных белков и пептидов, способных вызывать апоптотическую гибель раковых клеток и селективно подавлять рост опухоли является одним их активно развивающихся направлений поиска новых противораковых лекарственных средств. Такие проапоптотические соединения белковой природы как цитокины семейства фактора некроза опухоли, интерфероны, интерлейкины, некоторые вирусные белки (апоптин, белок NS1 парвовируса грызунов, белок E4orf4 человека), рибонуклеазы (онконаза, биназа, барназа), кротамин, белки и пептиды молока являются основой противораковых лекарств, которые уже используются в клинической практике или проходят различные этапы доклинических и клинических испытаний [Dimberg L.Y., 2012; Argiris K., 2011; Fang E.F., 2011; Hayashi M.A., 2012; Barbana C., 2011; Koval O.A., 2014]
Также одним из активно развивающихся направлений исследований при создании противоопухолевых лекарственных средств является использование способности некоторых вирусов избирательно уничтожать опухолевые клетки. Такие онколитические вирусы способны специфично разрушать злокачественные клетки, не оказывая значительного токсического воздействия на нормальные клетки организма. Подобное специфическое разрушение злокачественных клеток может происходить напрямую за счет преимущественной репликации вируса в этих клетках, или же оно может быть опосредовано иммунной системой, простимулированной вирусом [Sheridan C., 2013;; Schmidt C., 2013; Cawood R., 2012; Tedcastle A., 2012]
Природными онколитическими свойствами обладают многие вирусы, но вирус осповакцины (vaccinia virus, VACV) занимает среди них особое положение. Структурно-функциональная организация этого вируса хорошо изучена, и он имеет длительную историю успешного медицинского применения в качестве живой противооспенной вакцины. В онкотерапии используют аттенуированные штаммы VACV. Показано, что подавление генов тимидинкиназы (ТК) и ростового фактора (VGF, virus growth factor) VACV приводит к практически полному отсутствию репликации вируса в неделящихся клетках [McCart, 2007, US Patent N 7208313], при этом эффективность разрушения раковых клеток такими двойными мутантами (VVdd) не отличалась от исходного штамма [Thorne S., 2007].
Для увеличения онкоспецифичности и онколитической активности VACV используют способность этого вируса нести большое количество введенных инородных генов (трансгенов) [Кочнева Г., 2012]. В качестве трансгенов в геном вируса осповакцины вводили гены цитокинов и иммуномодуляторов, ингибиторов ангиогенеза, а также ферментов, превращающих внутри опухоли нетоксичные предшественники (prodrugs), в их цитотоксические производные [Ziauddin M, 2010; Guse K, 2010; Chalikonda S, 2008]. Полученные рекомбинантные VACV показали хороший противоопухолевый эффект в доклинических испытаниях.
В настоящее время три рекомбинантных штамма VACV, разрабатываемые американской компанией Jennerex Biotherapeutics, проходят клинические испытания в качестве противоопухолевых препаратов: онколитический вирус JX-929 (имеет делеции ТК и VGF генов, и вместо последнего встроен ген цитозиндезаминазы) проходит I фазу клинических испытаний для лечения рака яичников на стадии метастазов [Lee J, 2010]; JX-594 (введения гена гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) человека в район ТК-гена) успешно прошел I и II стадии клинических испытаний против первичного рака печени и меланомы [Marchesi V., 2013].
К настоящему времени известны ретровирусные конструкции, несущие ген апоптина, и показана избирательная индукция апоптоза раковых клеток с использованием таких векторов [Noteborn M., 2005]. Сконструированы рекомбинантные аденовирусы, экспрессирующие апоптин, и на модели опухолей печени человека в бестимусных мышах показана их противоопухолевая активность [Noteborn M., 2007; U.S. Zhang K-J., 2012].
Методы противоопухолевой терапии с использованием онколитических вирусов разрабатываются и в России. Сотрудники ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (г. Новосибирск) показали увеличение эффективности противоопухолевого действия вируса осповакцины при введении в его геном гена проапоптотического белка вируса анемии птиц – апоптина [Кочнева Г.В., 2013].
Введение в геном онколитических вирусов генов иммуностимулирующих белков (в частности ГМ-КСФ) индуцирует специфический противоопухолевый иммунитет и усиливает онколитическую активность вирусов за счет нарушения внутриопухолевой васкуляризации [Marchesi V., 2013].
Перспективным представляется создание рекомбинантного варианта вируса осповакцины с введением в геном VACV двух трансгенов: гена апоптоз-индуцирующего белка и гена ГМ-КСФ человека, что будет приводить к усилению лизиса раковых клеток, одновременному высвобождению большого количества слабо иммуногенных опухолеассоциированных антигенов и презентации их иммунной системе организма. Именно этот подход будет использован в данном проекте при выполнении работ по созданию кандидатного лекарственного средства.

4. В ходе выполнения проекта предполагается решить следующие задачи:

4.1. Разработать технологический процесс получения рекомбинантного штамма вируса осповакцины, содержащего двойную встройку генов: гена гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) человека и гена противоопухолевого белка лактаптина, и обладающего иммуностимулирующей и апоптоз-индуцирующей противоопухолевой активностью.
Все рекомбинантные варианты вируса будут получены на основе штамма Л-ИВП VACV, который имеет хорошую многолетнюю медицинскую историю применения, что будет способствовать облегчению условий проведения клинических испытаний препаратов на его основе.
Этапы проведения работ:
4.1.1 Подготовка ранее полученного авторами проекта рекомбинантного варианта VACV, штамм Л-ИВП, несущего встройку полноразмерной копии кДНК с матричной РНК ГМ-КСФ человека в структурной части гена вирусной тимидинкиназы (ТК).
Подготовка будет включать: наработку штамма на клетках 4647, аттестованных для производства вакцин в России; очистку вируса в градиенте плотности сахарозы (25-46%); титрование и Вестерн-блот для подтверждения экспрессии и секреции ГМ-КСФ.
4.1.2 Конструирование инсерционных векторных плазмид для получения делеционных по гену вирусного ростового фактора вариантов вируса осповакцины и для встройки вместо делетированного участка трансгена лактаптина.
4.1.3 Получение рекомбинантных вариантов VACV, несущих встройку гена ГМ-КСФ в ТК-гене и разные формы лактаптина в VGF гене.
4.1.4 Препаративная наработка, очистка и характеризация отобранных продуцирующих лактаптин клонов вируса.
4.1.5 Разработка лабораторного регламент получения рекомбинантного вируса осповакцины со встройкой генов ГМ-КСФ и лактаптина.

4.2. Провести испытания цитотоксической активности полученного рекомбинантного штамма осповакцины на культурах раковых клеток и нормальных клеток человека in vitro.
Этапы проведения работ:
4.2.1 Подбор и постановка культивирования культур раковых клеток человека и нормальной культуры клеток эпителия молочной железы человека для сравнительного анализа.
4.2.2 Оценка онколитической активности рекомбинантного вируса на раковых культурах клеток путем определения 50%-ной цитотоксической дозы (ИК50).
4.2.3 Сравнительный анализ ИКД50 рекомбинантного вируса для раковых и нормальных клеток и отбор раковых клеток, для которых онколитический эффект выражен наиболее сильно с целью дальнейшей оценки in vivo на экспериментальных животных.

4.3. Провести испытания противоопухолевой активности полученного рекомбинантного штамма осповакцины на опухолевой модели рака молочной железы in vivo.
Этапы проведения работ:
4.3.1 Подбор и/или закупка экспериментальных животных. Разработка метода прививки клеток опухоли молочной железы человека иммунодефицитным мышам и оценка динамики роста ксенографтов как моделей опухолей человека.
4.3.2 Подбор оптимальной схемы введения вирусного препарата. Измерение размера опухоли и количества метастазов при разных способах введения вирусного препарата.
4.3.3 Анализ органов экспериментальных животных на наличие патологических изменений в динамике после введения вируса, с целью определения диссеминации вируса в организме.
4.3.4 Иммуногистохимический анализ фрагментов опухоли и лимфоузлов в динамике не менее чем в двух временных точках после введения вируса, с использованием маркеров клеточного деления и апоптоза.
4.3.5 Электронно-микроскопический анализ фрагментов опухоли и прилегающих здоровых тканей с целью подтверждения адресности репликации вируса.

4.4. Провести испытания острой токсичности полученного рекомбинантного штамма осповакцины на лабораторных животных согласно «Руководству по проведению доклинических исследований лекарственных средств».

Основными рисками проекта могут являться:
1. В связи со сложной структурой апоптоз-индуцирующего белка лактаптина (большое количество пролинов в первичной структуре молекулы) может быть затруднена или невозможна секреция лактаптина через клеточную мембрану.
2. Введение гена лактаптина в геном вируса осповакцины может повлиять на цитотоксические свойства белка как в сторону увеличения, так и в сторону уменьшения его цитотоксичности.



Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
1. Полученные в результате выполнения проекта научно-технические результаты могут быть использованы в фундаментальных и прикладных исследования, а также при производстве лекарственных средств и в практическом здравоохранении:
- методика конструирования инсерционных плазмид, обеспечивающих встройку необходимых генов в геном осповакцины, и методика получения рекомбинантного штамма вируса осповакцины, содержащего две встройки генетического материала, могут быть использовании при создании рекомбинантных вариантов различных вирусов с заданными свойствами.
- полученный рекомбинантный штамм вируса, обладающий одновременно иммуномодулирующими и противоопухолевыми свойствами, может являться основой для создания фармацевтических субстанций и готовых лекарственных форм.
Результаты исследований, безусловно, будут являться патентоспособными:
- введение в геном онколитического вируса одновременно двух генов, продукты которых способны взаимно усиливать противоопухолевое действие друг друга (лактаптина, индуцирующий апоптоз-опухолевых клеток и иммуностимулирующий белок ГМ-КСФ), впервые применяется при разработке противоопухолевых лекарственных средств;
- способы (схемы) терапии злокачесвенных новобразований молочной железы человека разработанным кандидатным лекарственным средством также будут являться объектом патентования.

2. Основным потребителем результатов проекта будет являться Индустриальный партнер проекта ООО «Фабрика биополимеров», обеспечивающий 100% внебюджетного финансирования работ по проекту.
ООО «Фабрика биополимеров» - инновационное предприятие, созданное для организации производства биотехнологических лекарственных препаратов (рекомбинантных белков, моноклональных антител, цитокинов, ферментов), в том числе противоопухолевых препаратов на основе лактаптина и его аналогов. Предприятие создано холдингом ООО «ФармЭко» (предприятие ООО «ИРВИН-2», входящее в холдинг, является владельцем 51% доли уставного капитала) и ИХБФМ СО РАН (40% доли уставного капитала) в соответствии с ФЗ 217.
ООО «Фабрика биополимеров» имеет опытный участок для производства биотехнологических лекарственных препаратов, спроектированный и оснащенный согласно стандартам GMP.
Исполнители проекта будут проводить разработку и апробацию Лабораторного регламента получения кандидатного противоопухолевого лекарственного средства на основе рекомбинантного вируса осповакцины и апоптоз-индуцирующего белка лактаптина на опытном участке ООО «Фабрика биополимеров». На этом же участке планируется производство разработанного лекарственного средства для проведения доклинических и клинических исследований.

3. Результаты проекта будут востребованы исследовательскими организациями, биотехнологическими компаниями, разрабатывающими новые противоопухолевые препараты, фармацевтическими компаниями, которые занимаются производством противоопухолевых терапевтических средств, и организациями практического здравоохранения для терапии злокачественных новообразований и улучшения качества жизни онкологических больных.

4. Исследования и разработки в области создания новых противоопухолевых лекарственных средств, обладающих направленным воздействием на опухолевые клетки, стимулирующих противоопухолевый иммунный ответ и не оказывающих токсического действия на здоровые клетки организма, являются приоритетными во всем мире. Таким образом, результаты проекта будут востребованы международным научным сообществом, в том числе при представлении на международных конференциях, и могут являться основой для международных фундаментальных исследований и прикладных проектов.

Текущие результаты проекта:
Результаты первого этапа (2014 г):
1. Выполнен аналитический обзор современной научно-технической, нормативной и методической литературы, затрагивающей научно-техническую проблему, исследуемую в рамках ПНИ.
2. Проведены патентные исследования.
3. Разработана методика конструирования и очистки инсерционных плазмид для встройки гена лактаптина в район гена ростового фактора вируса (VGF). Сконструированы плазмиды pVGF-FR2-PE/L-Pat, pVGF-Sign-FR2-PE/L-Pat и pVGF-S short-FR2-PE/L-Pat.
4. Проведено депонирование инсерционных плазмид pVGF-FR2-PE/L-Pat и pVGF-Sign-FR2-PE/L-Pat в Государственной коллекции Роспотребнадзора возбудителей вирусных инфекций, риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» под номерами Р-57 и Р-56, соответственно.

Результаты второго этапа (январь - июнь 2015 г):
1. Разработана методика получения рекомбинантных штаммов вируса осповакцины на основе штамма VV-GMCSF-1/3. Получены три рекомбинантных варианта вируса осповакцины: 1) вариант с несекретируемой формой лактаптина - VV-GMCSF Lact,; 2) вариант с секретируемой формой лактаптина с длинной лидерной последовательностью - VV-GMCSF-S(long)-Lact; 3) вариант с секретируемой формой лактаптина с короткой лидерной последовательностью - VV-GMCSF-S-Lact.
2. Проведена оценка репликативных характеристик трех полученных рекомбинантных штаммов в культуре клеток CV-1. Все рекомбинантные штаммы эффективно реплицируются в клетках CV-1, культура клеток CV-1 может быть использована для независимой оценки инфекционного титра препаратов полученных рекомбинантных штаммов при всех дальнейших исследованиях.
3. Проведена оценка генетической стабильности рекомбинантных штаммов. Показано, что полученные рекомбинантные варианты вируса осповакцины имеют стабильную генетическую структуру в течение, по меньшей мере, 20-ти пассажей на культуре клеток и демонстрируют в ПЦР корректный размер фрагментов.
4. Оформлены паспорта рекомбинантных штаммов. Рекомбинантные штаммы задепонированы в Государственной коллекции Роспотребнадзора возбудителей вирусных инфекций, риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» под номерами VV-GMCSF Lact -
№ V-688; VV-GMCSF-S(long)-Lact - № V-689 и VV-GMCSF-S-Lac - № V-690.

Результаты третьего этапа (июль - декабрь 2015 г):
1. Отработана технология наработки и очистки рекомбинантных штаммов вируса осповакцины, продуцирующих ГМ-КСФ и лактаптин. Технология включает культивирование клеток 4647, аттестованных для производства вакцин в России, инфицирование их рекомбинантными штаммами вируса с множественностью 0,1 БОЕ/клетку, получение лизатов инфицированных клеток и выделение вируса методом центрифугирования в градиенте плотности сахарозы 25 - 40%. Концентрация вируса при таком способе очистки составляет, в среднем, 1 мг/мл. Чистота препарата вируса составляет не менее 90%. Инфекционность полученных экспериментальных образцов рекомбинантных штаммов составляет не менее 1х107 БОЕ/мл.
2. Разработан Лабораторный регламент наработки и очистки рекомбинантных штаммов вируса осповакцины.
3. Проведена наработка, концентрирование и очистка 4х экспериментальных образцов рекомбинантных штаммов вируса - VV-GMCSF Lact, VV-GMCSF-S(long)-Lact, VV-GMCSF-S-Lact и VV-GMCSF-dGF (контрольный рекомбинант, содержащий встройку гена ГМ-КСФ в районе гена тимидинкиназы и делецию гена VGF (virus growth factor)).
4. Проведена биохимическая, вирусологическая и молекулярно-генетическая характеризация экспериментальных образцов рекомбинантного вируса. Структура и стабильность рекомбинантных клонов подтверждена методом ПЦР и последующим секвенированием района встройки. Экспрессия гена лактаптина в составе рекомбинантных штаммов вируса осповакцины проанализирована методом иммуногистохимии в клетках почки китайского хомячка BHK. Цитотоксическая активность рекомбинантов в отношении клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF 7 и MDA-MB-231 подтверждена методом МТТ/ХТТ теста.
5. Проведен подбор методов анализа специфической активности экспериментальных образцов для разработки Программы и методики исследовательских испытаний экспериментальных образцов рекомбинантных штаммов вируса. Анализ специфической активности проводили на культурах опухолевых клеток человека в системе in vitro и на мышах с трансплантированными опухолями in vivo. В системе in vitro пролиферативную активность инфицированных клеток оценивали в режиме реального времени на приборе iCelligence и жизнеспособность клеток - методом МТТ/ХТТ теста. Динамику развития апоптотических изменений в клетках, инфицированных рекомбинантными вирусами, оценивали методом проточной цитофлуориметрии с применением йодида пропидия / Annexin V. Противоопухолевую активность рекомбинантных штаммов оценивали при интратуморальном введении рекомбинантных вирусов мышам с трансплантированными опухолями, рассчитывая индекс ТРО (торможение роста опухоли).
6. Проведены подбор и постановка культивирования клеток человека для проведения исследовательских испытаний. Подобраны условия культивирования следующих линий клеток: аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 (гормон-зависимый рак) и MDA-MB 231 (тринегативный рак), MCF-10А (кистозно-фиброзная мастопатия). Подобраны условия получения и культивирования клеток первичной культуры молочной железы BN1 (нетрансформированные клетки).
7. Подана заявка на изобретение № 2015145043 от 20.10.2015 "Рекомбинантный штамм VV-GMCSF-Lact вируса осповакцины, обладающий онколитической активностью и продуцирующий гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор человека и онкотоксический белок лактаптин".

Полученные результаты отвечают требованиям ТЗ и ПГ.
Информация о проекте размещена на официальном сайте Получателя субсидии в сети интернет по адресу
http://www.niboch.nsc.ru/doku.php/ru/science/grants/gk/2014_14.604.21.0057.

При выполнении проекта за счет внебюджетных средств (средства индустриального партнера ООО "Фабрика биополимеров) проведена
закупка материалов и оборудования для приготовления культуральных сред для наработки вируса, для получения и культивирования рекомбинантных штаммов вируса, а также для очистки и хранения рекомбинантных штаммов вируса.